インフルエンザウイルスのクライオ電子断層撮影法による赤血球凝集素のサブナノメートル分解能構造決定
2025年11月7日
この記事では、クライオ電子断層撮影法とそれに続く血球凝集素糖タンパク質のサブトモグラム平均を使用して画像化されたインフルエンザウイルスのデータ処理のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、画像の前処理から最終的なモデルの改良まで、段階的なデータ処理をカバーします。
私たちの研究室は構造生物学を用いてウイルスと薬剤耐性の進化を研究しています。本研究では、インフルエンザヘマグルチニンが受容体結合時にどのように構体構造を変化させるかを特徴付けています。私たちはクライオ電子断層撮影を活用し、ウイルスの形態の組織と構造を可視化しています。
具体的には、このクライオ電子顕微鏡法を用いて多形ウイルスインフルエンザの画像化を行っています。当プロトコルにより、未保存ウイルス上のインフルエンザヘマグルチニンの組織構造をサブナノメートル分解能で研究できます。この高解像度により、これまで隠されていた相互作用を可視化できます。
まずは、Conda環境を起動するためのLinux端末を起動します。ターミナルを使ってISOネットをインストールしたConda環境を起動します。「tomo folder」というサブフォルダを作成し、すべてのトモグラムファイルをそのフォルダに移動させます。
次に、そのコードを使ってプロジェクトフォルダ内のスターファイルを生成します。テキストエディタを使って生成された星形ファイルを開き、0度傾き画像のおおよそのデフォーカス値を4列目に入力します。次に端末でCTFD畳み込みコマンドを実行します。
デコンボリューション後、EMAN2のGUI環境を起動し、パーティクルピックのための前処理を開始します。トモグラフィーの欄で、生データの横にある矢印を左クリックし、ドロップダウンメニューからトモグラムのインポートを選択し、ファイルを選びます。次に、分割の横にある矢印を左クリックして、事前処理済みトモグラムを選択します。
適切なデフォルトパラメータを使いましょう。前処理後、プロセスのトモグラフィーファイルのベース名に一致する空白のJSONファイルを含む情報ディレクトリが自動的に作成されます。進める前にファイルにオングストロームピクセル情報を追加してください。
畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を学習してHA糖タンパク質を認識させるには、使用予定のトモグラムの場所をワーキングディレクトリに変更します。その後、端末を使ってCNNトレーニングインターフェースを開きます。窓が4つ開いているか確認してください。
1つはディレクトリ内のCNNパラメータやトモグラムの情報、残りの3つのウィンドウにはCNNが選択した良い参照点、悪い参照点、粒子の画像が入っています。CNNのGUIで、新しいオプションをクリックして、デフォルトの学習率0.0001、ボックスサイズ8のCNNを初期化できます。ファイル名列の下で、代表的なトモグラムを左クリックして開きます。
開いているトモグラムの上にカーソルを合わせ、マウスのスクロールホイールをクリックすると新しいウィンドウが開きます。左クリックでNの数字スライダーを操作してZ軸を移動します。次に、オープントモグラムで良好な参考パネルを使ってHAに対応する10〜20の特徴を選択します。ポジティブウィンドウにはポジティブイメージが現れます。
削除するには、Shiftを押しながら左クリックしてください。次に悪い参照パネルに切り替え、空の膜パッチ、RNP密度、フィデュシャルマーカー、デブリなどの特徴に対応する10〜20の参照を選択します。反復回数を50に設定し、列車アイコンをクリックしてCNNトレーニングを開始します。
トレーニング終了後は「適用」ボタンを押してください。選ばれた粒子はトモグラム上で青い丸として表示されるか、粒子ウィンドウで確認できます。さらに、ポジティブ・ネガティブなリファレンスを追加で選択し、定期的に保存をクリックして進行状況を保持しましょう。
CNNが満足のいく動作をしたら、「全て適用」をクリックして粒子選択を実行します。その後、複数のトモグラムで結果を評価し、必要に応じて再トレーニングを行います。各トモグラムの座標を保存するには、コマンド e2projectmanager.py を使ってEMAN2のGUIを再起動してください。
サブトモグラム平均の矢印をクリックして、手動ボクシングを選択してください。次に、トモグラムの名前を入力して「起動」をクリックします。次に、ファイルをクリックし、ボックスコードを保存し、tomogram_haします。
座標を保存するためにtxtを送ります。Neural Netのサブフォルダとinfoサブフォルダに移動してバックアップとネットセーブを行ってください。HDF、列車の出発。
HDF、隔離政策。hdf、およびboxes3Dref.hdf。トレーニングボックスのサイズを8から14に変更して、2つ目のCNNを訓練してM1タンパク質層とVRNPの存在を検出します。
パーティクルをキュレーションするには、まずGitHubリポジトリからノートブックをダウンロードしてください。次に、IPYNBノートブックをCNNパーティクルクリーニングして必要なモジュールを読み込みます。HAとM1の座標テキストファイルをノートブックに読み込みます。
オープンな3Dライブラリを使って3D雲として表示してください。次に、オープン3D統計的外れ値除去法を用いてHA座標の外れ値をフィルタリングします。次に、HA点群とM1点群間の距離を計算し、M1から20ピクセル以上離れたHA点を外れ値として特定し、残りの座標を出力テキストファイルに保存します。
すべてのパーティクルを連結し、pts2 star fileを使ってstarファイルとして保存します。IPYNB。WarpToolsを用いて、4倍の係数を曲げる粒子を抽出し、コードを使ってRELION-4の初期サブトモグラム平均を行います。ワープスターファイルをRELION 4形式に変換してください。
次に、RELIONのリファインMPIを使って粒子のサブセットに対して初期参照を生成します。RELION refine MPIでサブトモグラムの3D自動精緻化を行います。収束後、タイタンの移動を8にオフセットし、ステップを2にして自動精錬を繰り返します。
RELIONの精錬を用いて2D分類を活用してジャンク粒子を廃棄しましょう。コードを使って良いクラスのスターファイルを作成し、その後個別のスターファイルを組み合わせます。代表的なトモグラムでは、球状から細長い形状まで多様な多形型ウイルス粒子が明らかになりました。
最終的なサブトモグラム平均は、局所分解能が5〜7オングストロムの範囲で、グローバル解像度は6.0オングストロムに達しました。最終的なHA再構築ではアルファヘリックスとベータシートが解明され、精緻マップの構造的品質を支持しました。HAの頭部および茎の4か所で糖鎖化部位が確認され、最終再構築時に糖団密度の可視性が確認されました。
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概要
この記事では、凍結電子断層撮影法を用いて、受容体結合時におけるインフルエンザ血球凝集素の構造を研究するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、サブナノメートル分解能でウイルスの形態と構造の可視化を可能にします。
主要な研究要素
科学分野
- 構造生物学
- ウイルス学
- 凍結電子断層撮影法
背景
- インフルエンザウイルスは多形性の形態を示します。
- 血球凝集素は受容体結合に関与する重要な糖タンパク質です。
- 構造変化の理解は薬剤耐性研究に情報を提供します。
- 凍結電子断層撮影法は高解像度の画像化能力を提供します。
研究目的
- 受容体結合時の血球凝集素の構造変化を特徴づける。
- インフルエンザウイルスの組織と構造を可視化する。
- 分子レベルでのウイルス相互作用の理解を深める。
使用方法
- ウイルス構造の画像化のための凍結電子断層撮影法。
- モデル改良のためのサブトモグラム平均法。
- データ強化のための画像前処理技術。
- 完全なウイルス上の血球凝集素のin situ可視化。
主な結果
- サブナノメートル分解能でのインフルエンザ血球凝集素の画像化に成功。
- 受容体結合時のこれまで隠れていた相互作用の特定。
- ウイルスの組織化に関する詳細な構造的洞察。
- ウイルス糖タンパク質の将来の研究のためのプロトコルの確立。
結論
- このプロトコルはインフルエンザ血球凝集素の高解像度分析を可能にします。
- 結果はウイルスの構造と機能の理解に貢献します。
- このアプローチは構造生物学における他のウイルス研究にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Subnanometer-resolution cryo-electron tomography of influenza hemagglutinin (HA) enables direct structural interrogation of viral glycoproteins in their native context, addressing a critical challenge in target validation for antiviral discovery. This workflow enhances predictive confidence in structure-based drug design and supports mechanistic de-risking at the earliest stages of antiviral portfolio development. The robust pipeline for HA visualization on intact virions positions structural biology as a foundational capability for translational virology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HA conformation and organization on pleomorphic influenza virions.
- Supports functional target validation by resolving glycosylation sites and protein-protein interactions at subnanometer scale.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural features relevant to receptor binding and membrane fusion.
- Improves predictive confidence for downstream inhibitor or vaccine design targeting HA.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for in silico screening and rational design workflows.
- Standardizes particle picking and subtomogram averaging for reproducible structural outputs.
- Enables quantitative assessment of glycoprotein density and distribution on virion surfaces.
- Supports assay development by confirming the presence and accessibility of key epitopes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural findings with disease-relevant viral strains and glycoprotein variants.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation of HA-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates by providing high-resolution structural benchmarks.
Pipeline & Workflow Integration
This cryoET pipeline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research for antiviral programs.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution structural data to test mechanistic hypotheses about HA function and viral entry.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative structural outputs for computational and experimental screening platforms.
- Analytics: Provides robust measurements of glycosylation, secondary structure, and protein organization for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by characterizing clinically relevant viral strains.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modular workflow for structural analysis of diverse viral glycoproteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target structure and function.
- Operational Value: Standardizes data processing and analysis for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes candidates with validated structural engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of antiviral assets based on structural benchmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron tomography, image processing, and neural network-based particle picking.
- Demands access to high-performance computing infrastructure and specialized software (e.g., EMAN2, RELION).
- Necessitates cross-team standardization of data formats, annotation, and quality control.
- Adaptation to other viral systems may require retraining of neural networks and protocol optimization.
- Resolution and throughput are limited by sample heterogeneity and data acquisition constraints.
