肺癌の同系同所性マウスモデルを生成するための低侵襲法

現在の研究は、肺がん疾患の理解と、化学療法、放射線療法、免疫療法などの標準治療と両立する新しい治療法の開発に焦点を当てています。早期肺がんを特異的に研究する基準を確立した直位性肺がんモデルは見つかりませんでした。このプロトコルのギャップを埋めるための明確かつ再現可能なガイドラインを提供するよう努めています。

このプロトコルは侵襲が最小限で、実施も簡単です。さらに、提供した基準により、このプロトコルは正確な腫瘍移植のスクリーニングを可能にし、生物発光画像診断による早期腫瘍検出を可能にします。このプロトコルにより、研究者は宿主組織における早期肺がんを研究でき、新規がん治療薬の前臨床的進展や腫瘍微小環境の調査が可能となります。

この技術を用いて、刺激的な新しい肺がん治療のメカニズムと有効性を臨床的に評価し、将来の患者ケアにつながることを期待します。まず、麻酔をかけたマウスを温め装置の上で伏せた姿勢で鼻のコーンに入れ、両目に眼軟膏を塗ります。麻酔が確認されたら、電動クリッパーを使ってネズミの左側背面にある2×3センチの長方形の部分から毛を除去します。

背骨から内側、テーブルから外側、最後の肋骨は下側、肩甲骨の上端は頭部に向かって毛が見えなくなるまで剃ります。ネズミを空のケージに入れ、温め装置に入れます。マウスが意識を取り戻すまで呼吸パターンを観察し、その後手術まで元のケージに戻します。

細胞採取当日には、採取の3〜4時間前に50ミリグラム/ミリリットルのゲンタマイシンを含む新鮮培地を培養皿に加えます。培地を培養皿から吸引し、付着した細胞を1倍PBSで洗浄します。その後、トリプシンEDTA溶液で細胞を37度で1〜2分間培養します。

トリプシンを中和するために新しい培地を加えます。プレートを優しく叩くかピペットで細胞を分散させます。次に、細胞懸浮液を50ミリリットルの円錐形チューブに集めます。

次に、円錐形の管を室温で1,200Gで3分間遠心分離します。底部にコンパクトなペレットがあることを確認すると、上清液を吸引し、PBSでペレットを洗浄します。洗浄された細胞ペレットをPBSで再懸浮させ、約1ミリリットルあたり100万から200万細胞の濃度にしてカウントします。

作業前に40マイクロメートルのセルストレーナーで懸濁液をろ過してください。次に、細胞懸濁液10マイクロリットルとトリパンブルー10マイクロリットルを混同します。染色したサンプルをヘモサイトメーターに取り込み、細胞数を数えます。

細胞の総数と細胞の生存能力を計算します。細胞を室温で1,200 Gで3分間遠心分離し、ペレットから出るPBSを吸引します。細胞ペレットを0.5ミリグラム/ミリリットルのメタラゲルにPBSで再懸浮させます。

総注入容量50マイクロリットルで希望の細胞数に調整します。細胞の懸浮液は氷の上に置いて、マトリジェルの固化を防ぎましょう。麻酔動物の手術部位を滅菌ガーゼで3回洗浄し、ベタジンと70%エタノールを交互に使用します。

滅菌された開口部付きの開口部を持つ開口部の開口部をマウスの上に置き、その上にオートクレーブ手術器具を並べます。鉗子を使って肩甲骨の頭蓋縁と胸肋骨のコドルエッジを特定します。外科医の親指と人差し指で皮膚を張った状態で、サイズ10のメス刃を使って肩甲骨の真下に浅い5ミリメートルの皮膚切開を行います。

次に115ミリメートルの直線ハサミで、肋骨や肋間筋を切断せずに皮下脂肪を鈍く剥離します。毛細血管損傷による軽い出血を防ぐために、滅菌された綿先端のアプリケーターを出血部位に軽く押し当ててください。切開部をマイクロアドと鉗子で開いたまま保ちます。

7番目の真肋骨から始め、曲線を描いた中央点の鉗子を使って上に数え、4本目と5本目の肋骨を見つけます。この部位を注射部位としてマークしてください。次に、セル懸濁管を優しく3〜4回逆さにして混ぜます。

注射直前に、50マイクロリットルの懸濁液を無菌の300マイクロリットル31ゲージ8ミリインスリン注射器に吸い込み、気泡がないか確認してください。4ミリの厚さの滅菌済み金属テープを注射器に流してストッパーとして使い、注射深度をコントロールします。50マイクロリットルの細胞懸液を4本目の肋骨のすぐ下、肋骨4番と5番の間の肋間隙に90度の角度で注入し、針を2〜3秒間そのまま保持します。

針を挿入した時と同じ角度でゆっくりと引き抜き、鋭利な容器に捨てます。最後に、皮膚切開部を2〜3本の四角い結び目で閉じ、縫合線に獣医用外科用接着剤を塗布して傷口の閉鎖を強化します。生物発光イメージングにより、実験マウスでは注射後1日以内に腫瘍関連シグナルが検出され、25,000および50,000細胞群で放射性が時間とともに目に見えて増加し、50,000細胞群でより強い光輝が観察されました。

25,000細胞群と50,000細胞群の両方で腫瘍フラックス総量が指数関数的に増加し、50,000細胞群では21日目までに10×10を超えて毎秒8光子の乗数に達しました。偽マウスでは解離された肺に発光や腫瘍が見られず、実験マウスでは肺組織に高い発光と赤色腫瘍塊が認められました。注射後21日時点で、含まれたマウスは左肺葉に腫瘍が局限し、周囲領域への浸潤は見られませんでした。