Name: マイクロ流体二重層デバイスを用いた微生物1細胞増殖解析における急速酸素振動の創出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶマイクロ流体二重層デバイスを用いた微生物1細胞増殖解析における急速酸素振動の創出方法。制御された酸素環境下で微生物の応答を正確に評価し、環境微生物学や代謝研究への応用が期待されます。

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1.金型の準備
<ol>
	<li>3Dプリントで最上層の型を準備します。得られたPDMS最上層の表面が滑らかになるように、表面が滑らかな最上層の金型を作製します。光造形(SLA)3Dプリントの使用をお勧めします。<ol>
		<li>3D CADソフトウェアで金型を設計します(図1A)。設計に、下部の流体チャネルと重なるガスチャネルが含まれていることを確認します。この設計プロセスは、最下層の設計と並行して実行します(手順1.2.1)。</li>
		<li>SLA 3Dプリントを使用して金型をプリントします。プリントしたモールドから残ったレジンを取り出し、イソプロピルアルコール(IPA)浴で30分間洗います(図1B)。</li>
		<li>樹脂の種類や形状に応じて適切な時間と温度で金型を405nmの光にさらして、二次硬化を行います。</li>
		<li>型をIPAに超音波浴で15分間浸し、型に残っている未硬化の樹脂を取り除きます。これにより、PDMSの硬化が阻害される可能性があります。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最下層にシリコンウェーハモールドを準備します。<ol>
		<li>CADレイアウトエディタでマイクロ流体チップを設計します(図1C)。設計に入口、流体チャネル、および出口が含まれていることを確認します。</li>
		<li>前の論文(図1D)16で説明したように、2層フォトリソグラフィーを使用してシリコンウェーハモールドを作成します。 注:最下層のチャネルはμmのサイズであり、正確な製造が必要ですが、最上層のチャネルはmmのサイズです。SLA 3Dプリンティングは、製造時間が短く、したがってプロトタイピングが迅速であるため、SLAプリンティングは、最上層の金型のかなり大きな構造の製造に使用されました。最下層はフォトリソグラフィーで作製し、精密な造形を実現しました。最上層のチャンネルもμmの範囲にあり、精度が必要な場合は、フォトリソグラフィーを使用したモールドの製作も検討してください。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS二重層マイクロ流体チップ作製
<ol>
	<li>PDMS予備硬化液は、塩基剤と硬化剤を10:1の割合で十分に混合して調製します。混合物をデシケーターで1時間脱気します。</li>
	<li>最上層の金型をIPAで洗浄し、圧縮空気で乾燥させます。</li>
	<li>PDMSを最上層の金型に流し込み、続いて80°Cで20分間熱硬化させます(第 1硬化ステップ、 図1E)。1回目の 硬化ステップでは、PDMSが完全に硬化していない間、PDMSの剥離、切断、およびパンチングが可能です。</li>
	<li>20分間加熱した後、手またはピンセットでPDMSの粘着性を確認してください。PDMSがまだ粘着性がある場合は、加熱時間を調整してください。</li>
	<li>最上層の型からPDMSをはがし、1つの部分(ここでは20 mm x 18 mm)にカットします。ガス入口用のパンチ穴(直径= 0.75 mm)(図1F)。最上層の底面は、IPAですすぎ、圧縮空気で乾燥させ、粘着テープを貼って清掃します。</li>
	<li>最下層の型をIPAで洗浄し、圧縮空気で乾燥させます。最下層の金型をスピンコーターに固定し、金型の中央にPDMSを流し込みます。PDMSをウェーハの近くに注ぎ、気泡を減らします。PDMSを注いだ後に気泡が見つかった場合は、清潔なピンセットまたは針を使用して気泡を外側に移動します。</li>
	<li>PDMSを最下層の金型に1000rpmで60秒間スピンコートし、続いて80°Cで10分間熱硬化させます(1回目の 硬化ステップ、 図1G)。10分後にPDMSの粘着性を手作業またはピンセットで確認し、必要に応じて加熱時間を調整します。</li>
	<li>最上層のPDMSピースを金型の最下層のPDMS層に置き、上からしっかりと押して、上層と下層の表面が確実に取り付けられていることを確認します(図1H)。</li>
	<li>PDMSを80°Cで少なくとも1時間熱硬化させます(2回目の 硬化ステップ)。2番目の 硬化ステップでは、最終的な PDMS 硬化が可能になり、上層と下層が不可逆的に結合されます(図 1H)。</li>
	<li>PDMSの最下層をそっと切ります。PDMSチップ全体を金型から慎重に剥がします(図1H)。 注:PDMSチップが金型から剥がれにくい場合は、シラン化や化学表面コーティングなど、最下層の金型をさらに表面処理して、剥離手順を容易にすることを検討してください。剥がれながら上層と下層が剥がれる場合は、1回目の 硬化ステップの時間を短縮することを検討してください。</li>
	<li>流体チャネルの両端に流体の入口と出口用のパンチ穴(直径= 0.5 mm)があります(図1H)。チップの底面は、IPAですすぎ、圧縮空気で乾燥させ、スコッチテープを貼って丁寧に清掃してください。</li>
	<li>チップを厚さ0.175mmのカバーガラスに接着し、プラズマ酸化により表面を活性化します(25秒、 図1H)。</li>
	<li>チップをガラス基板に載せた後、最上層を加圧空気で洗い流し、PDMSメンブレンの最下層がガラスに適切に取り付けられていることを確認します。</li>
	<li>ボンディングされたチップを80°Cで10秒から1分間加熱して、ボンディングの安定性を高めます。 注:前述のPDMS硬化ステップと必要な硬化時間は、金型の厚さ、機器、周囲条件などのさまざまなパラメータの影響を受ける可能性があります。したがって、提案されたプロトコルがアプリケーションに適さない場合に備えて、硬化時間を調整してください。</li>
</ol>
3. 実験セットアップ
注:標準的な実験装置として、相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラ、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)カメラ(周波数領域)、および温度インキュベーターを備えた倒立顕微鏡が使用されます。変調励起レーザー光源(445 nm、100 mW)がFLIMカメラに接続されています。ガス制御には、3つのマスフローコントローラー(窒素、酸素、二酸化炭素)が使用されます。シリンジポンプは、中程度の灌流に使用されます。
<ol>
	<li>ガス(入口)と流体(入口と出口)の灌流用のチューブを準備します。実験の前にインキュベーターの電源を入れて、目的の温度(ここでは37°C)に到達します。</li>
	<li>目的の対物レンズ(ここでは、酸素検出用に20倍、微生物観察用に100倍)を選択し、必要に応じて浸漬油を追加します。2層チップを接着剤でチップホルダーに固定します。</li>
</ol>
4. 酸素制御とセンシングを内蔵
<ol>
	<li>適切な濃度の酸素感受性色素溶液を調製します(ここでは、3 mM tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydrate、RTDP)。</li>
	<li>既知の寿命(ここでは3.75 ns)の参照スライドを使用して、FLIMカメラをキャリブレーションします。FLIMカメラで信号強度を測定し、露光時間または顕微鏡の絞りを調整して0.68〜0.72の信号強度を達成して、キャリブレーションを改善します。</li>
	<li>チップホルダーを顕微鏡ステージに固定します。適切なチューブを流体の入口と出口に接続します。シリンジポンプ(ここでは100 nL/min)を使用して、一定の流量で酸素感受性色素溶液の灌流を開始します。</li>
	<li>ガスインレットとマスフローコントローラーを適切なチューブで接続します。制御された酸素濃度(ここでは酸素0%または21%、総質量流量600mL / min)でガスのフラッシングを開始します。</li>
	<li>酸素がない場合(τ0)と別の既知の酸素濃度(ここでは21%)で相寿命を測定します。消光定数 (Kq) は、酸素存在下での蛍光消光を表す Stern-Volmer 方程式を使用して次のように計算します。あるいは、蛍光強度(I)を使用することもできます。ただし、強度ベースの測定は、光源強度の変動、光の退色などの影響を受ける可能性があります。 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> 注:特に酸素枯渇レベルを0%と低く目標としている場合は、正確なキャリブレーションを確保するために、ガスフラッシングを開始してから数分間待つことをお勧めします。精度を向上させるには、酸素スカベンジャーの使用や追加の密閉チャンバーセットアップなど、追加の酸素枯渇方法でプロセスを補完することを検討してください。</li>
	<li>相の寿命を測定し、Stern-Volmer 方程式を使用して対応する酸素濃度を計算します。振動する酸素条件を作り出すには、任意の機器制御システムを使用して、窒素と酸素の体積流量を自動的に調整します。</li>
</ol>
5. 細菌培養の準備
<ol>
	<li>.目的の微生物(ここでは、 大腸菌 MG1655、フラスコごとにクライオバイアルからすぐに使用できるビーズ1つ)を目的の培地(ここでは、10 g/Lのペプトン、5 g/L酵母抽出物、および10 g/L NaClを含むLB培地)に接種してプレカルチャーを開始し、一晩(ここでは150 rpmで37°C)インキュベートします。</li>
	<li>得られた光学密度を、光度計を使用して 600 nm (OD600) で測定します。</li>
	<li>前培養(ここでは初期OD600 = 0.3または0.0001)を接種することにより、LB培地で次の培養を開始します。指数関数的な成長段階に達するまで培養物をインキュベートします。 注:オンチップ培養用の培地が第1の前培養培地と異なる場合、生物が新しい培地16に慣れるように、オンチップ培養用の培地を用いて第2の予備培養を行うことが望ましい。</li>
	<li>培養物を適切な光学濃度に希釈することにより、播種溶液を調製します。次のステップのために、播種溶液を1mLシリンジに移します。 大腸菌の場合、播種液の光学濃度(OD600)は約0.5でした。</li>
</ol>
6. 酸素制御条件下でのオンチップ微生物培養とタイムラプスイメージング
<ol>
	<li>チップホルダーを顕微鏡ステージに固定します。チップホルダーとPDMSチップをインキュベーター(ここでは37°C)で数時間温めると、温度に伴う変位によるタイムラプスイメージング中の焦点ぼけのリスクが軽減されます。</li>
	<li>培養を開始する前に、総流量と二酸化炭素流量を一定に保ちながら、酸素と窒素の質量流量の体積パーセントを調整し、希望の初期酸素濃度でガス化を開始してください。</li>
	<li>チップのガス入口とマスフローコントローラーを接続します。</li>
	<li>シリンジと播種溶液を液体出口に接続し、シリンジを手動で押すことにより、生物をチップに播種します。細胞が培養チャンバーに正常に閉じ込められているかどうかを顕微鏡で確認します。</li>
	<li>細胞接種後、シリンジを取り外し、新しい培地と別のシリンジを液体入口に接続します。シリンジを手動で押して、培地供給チャネルに残っている細胞を洗い流します。</li>
	<li>シリンジポンプを使用して、一定の流量(ここでは100 nL / min)で培地の灌流を開始します。不十分な流量はチャンバーの乾燥につながる可能性があるため、十分な流量を確保してください。十分な流量は、流体チャネルの形状や最上層チャネルのガス流量など、いくつかの要因によって異なります。</li>
	<li>タイムラプス画像取得を開始します。振動する酸素条件下での培養は、画像取得開始と同時にマスフローコントローラーの自動制御を開始してください。ガス制御と画像取得の開始に遅延がある場合は、後で画像データ解析を行うために遅延を考慮に入れてください。</li>
</ol>
7. 画像データ解析
<ol>
	<li>タイムラプス画像を位置ごとに1つの画像スタックとして保存します。</li>
	<li>画像解析プログラムを使用して、培養コロニーを回転、整列、トリミングするために、画像を前処理します。前処理された例。TIFの画像はこちらからご覧いただけます: https://doi.org/10.5281/zenodo.1398274715</li>
	<li>細胞をセグメント化し、細胞数、長さ、面積、蛍光強度などの関連値を抽出します。成長行動をさらに分析します。Python スクリプトの例は、https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515 から入手できます。</li>
</ol>

<ol><li>Cabiscol, E., Tamarit, J., Ros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+bacteria+and+protein+damage+by+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species.</a> Int Microbiol. 3 (1), 3-8 (2000).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>クレウィン5</td><td>WieWeb ソフトウェア、オランダ</td><td>該当なし</td><td>レイアウト エディター</td></tr><tr><td>CMOSカメラ</td><td>ニコン、日本</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Schott AG, ドイツ</td><td>D263バイオ</td><td>39.5 mm x 34.5 mm x 0.175 mm</td></tr><tr><td>フェムトプラズマクリーナー</td><td>Diener Electronics、ドイツ</td><td>-</td><td>チッププラズマボンディング</td></tr><tr><td>フォーム3B</td><td>Formlabs、米国</td><td>-</td><td>3Dプリンター</td></tr><tr><td>ライフタイムリファレンス</td><td>Starna Scientific、英国</td><td>UMM-SFGの</td><td></td></tr><tr><td>マスフローコントローラー</td><td>V&ouml;gtlin Instruments GmbH、スイス</td><td>GSC-A9SA-BB22</td><td>窒素, 酸素</td></tr><tr><td>マスフローコントローラー</td><td>V&ouml;gtlin Instruments GmbH、スイス</td><td>GSC-A9SA-BB21</td><td>二酸化炭素</td></tr><tr><td>モデルv3樹脂</td><td>Formlabs、米国</td><td>RS-F2-DMBE-03</td><td>3Dプリント樹脂</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>3957.1</td><td>LB中成分</td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Ti-E 2</td><td>ニコン、日本</td><td>-</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>pco.flimカメラ</td><td>PCO AG、ドイツ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pco.flimレーザー</td><td>Omicron-Laserprodukte GmbH、ドイツ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>8986.1</td><td>LB中成分</td></tr><tr><td>プラン Apo & ラムダ;</td><td>ニコン、日本</td><td>-</td><td>100倍油、20倍</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>ダウ・ケミカル・カンパニー、米国</td><td>Sylgard 184 シリコーン エラストマー キット</td><td></td></tr><tr><td>パンチングツール、&Phi;0.50ミリメートル</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ、米国</td><td>504528</td><td></td></tr><tr><td>パンチングツール、&Phi;0.75ミリメートル</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ、米国</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Store クライオバイアル</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016 x64 エディション</td><td>ダッソーシステムズ、フランス</td><td>該当なし</td><td>3D CAD</td></tr><tr><td>基板スピンコーター</td><td>APT Automation、ドイツ</td><td>スピン150i</td><td>PDMSスピンコーティング</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>CETONI, ドイツ</td><td>ネメシス</td><td></td></tr><tr><td>温度インキュベーター</td><td>Okolab, イタリア</td><td>-</td><td>顕微鏡装置</td></tr><tr><td>トリス(2,2'-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II)六水和物、(RTDP)</td><td>Acros Organics、ベルギー</td><td>208750010</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>サンゴバン、フランス</td><td>タイゴン F-4040-A</td><td>ガスインレットチューブ</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>サンゴバン、フランス</td><td>タイゴンAAD04103</td><td>流体チューブ</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>カール・ロス、ドイツ</td><td>2363.3</td><td>LB中成分</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体二重層デバイスを用いた微生物1細胞増殖解析における急速酸素振動の創出

Creating Rapid Oxygen Oscillations in Microbial Single-cell Growth Analysis using a Microfluidic Double-layer Device

PDMS二重層チップ製造 作製した2層チップを 図2Aに示し、可視化のために色付きのガスチャネル(赤)と流体チャネル(青)を示しています。チップには、3つの同一の流体チャネルと重なり合うガスチャネルがあり、並列実験が可能です。流体チャネルには、一連の培養チャンバーを備えた栽培エリアがあります(図2A(i))。培養室内に細胞を閉じ込め、単層状に増殖させることで、高い画像取得率で高解像度のタイムラプスイメージングが可能になります。チップの断面は、厚さ3mmのトップレイヤーと65μmの厚さのボトムレイヤーを示しており、中間PDMSメンブレンを介してガスチャネルから流体チャネルへの高速ガス拡散を可能にしています(図2A (ii-ii'))。
オンチップ酸素制御 開発したチップのガス交換能力は、FLIMと酸素感受性色素15を用いて試験した。 図2Bに示すように、流体チャネル内の酸素濃度は、酸素濃度が21%から0%の間でシフトしたときに、対応する減少または数十秒以内の増加を示しました。これらの酸素測定結果は、開発した2層マイクロ流体チップにおいて、数十秒での急速な酸素振動を再現できることを示しています。
一定の酸素条件下での微生物培養 このチップは、さまざまな酸素濃度の一定のガス状条件下での通性嫌気性菌の増殖を特徴付けるために最初に採用されました。予備実験では、二酸化炭素の枯渇により大腸菌の増殖が制限されることが観察されたため、供給ガスには必ず二酸化炭素が添加されていました(データは示されていません)。図3Aおよび図3Bは、それぞれ好気性(21%酸素供給)および嫌気性(0%酸素供給)条件下での大腸菌の代表的な位相コントラスト画像を示しています。培養の3時間後、好気性条件下で増殖した大腸菌は、嫌気性条件と比較してより大きなコロニーをもたらしました。定量分析では、図3Cの成長曲線に示すように、酸素の利用可能性に応じてコロニーサイズ(Aコロニー)の増加率が異なることも示されています。Aコロニーは、異なるコロニーや条件で比較できるように、初期面積で正規化されることに注意してください。指数関数的成長率μは、次のように成長曲線から決定でき、図3Dにまとめられます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq2.jpg">
この結果は、目標とする濃度で酸素を制御し、取得したタイムラプス画像から対応する微生物の成長を効果的に分析するデバイスの能力を検証しています。
振動する酸素条件下での微生物培養 最後に、大腸菌を振動する酸素条件下で培養し、好気性ガス相と嫌気性ガス相を切り替え間隔T'で切り替えました。60分から1分までのさまざまなT'を調べて、振動する酸素条件と相関する時間分解成長分析の能力をテストしました。図4は、T' = 60、30、10、5、2、および1分間の振動酸素条件下での大腸菌の増殖を定量化したものです。Aコロニーに基づく成長曲線に加えて、Δt μ瞬間的な成長率も次のように時間分解された洞察を獲得するために決定されます。
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq3.jpg">
一定の好気性および嫌気性条件下での成長率も、成長の参考として図4に点線(μ 21%、μ0%)で示されています。大腸菌の成長は、振動するガス状条件に応答して明確なダイナミクスを示しました。例えば、ガス注入期を好気性状態から嫌気性状態に切り替えた後(T' = 60分)、成長は(i)応答期:成長率の急激な低下、続いて(ii)回復期:成長率の緩やかな増加、(iii)安定化期:0%前後μの成長安定化を示しました。大腸菌の成長動態は、1分という短い時間でさまざまなT'の下で時間的に成功裏に解決されましたが、そこでは、大腸菌は、変化するガス状条件に成長を適応するための時間が限られているため、上下に単調な成長速度を示しました。さらに、成長挙動はコロニーレベルだけでなく、シングルセルレベルでも解析することができます。図5は、さまざまなスイッチング間隔T'での酸素振動下での単一細胞領域の発達を示しています。シングルセルの成長は、トラッキング解析なしで、隣接するプロットをたどることで推測できます。単一細胞レベルでの成長挙動は、図4のコロニーレベルで観察されたものと似ています。好気性ガス化段階での面積の増加が速く、ガス切り替えイベントでの成長速度が明らかに変化します。今回の結果は、振動するガス状条件下で微生物を培養し、酸素の利用可能性と相関する微生物の増殖を時間分解法で解析する能力を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig1.jpg"> 
図1:2層チップ製造手順。 手順は、(A、C)金型設計、(B、D)金型製作、(E-G)PDMS成形、(H)チップ組立から始まります。このフィギュアは15から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig2.jpg"> 
図2:作製した2層チップとその酸素制御機能 (A)作製したチップの代表的な画像を示し、色付きのガスチャネル(赤)と流体チャネル(青)を可視化しています。SEM画像は(i)に示されており、両側の流体チャネルに接続された一連の培養チャンバーを示しています(スケールバー100μm)。チップの断面を(ii-ii')で示し、厚さ3mmのトップレイヤーと65μmの厚さのボトムレイヤーを示しています。(B)好気性(21%酸素)条件と嫌気性(0%酸素)条件の切り替え後に測定された流体チャネル内の酸素濃度。このフィギュアは15から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig3.jpg"> 
図3:一定の酸素条件下での 大腸菌 の培養。 (A)細胞を好気的に培養し(酸素供給量21%)、3時間、位相差顕微鏡を用いてタイムラプス画像を取得する。(B)細胞を嫌気的に培養し(酸素供給0%)し、3時間分のタイムラプス画像を取得し、(C)種々の恒常酸素条件下での細胞増殖を Aコロニーに基づいてプロットする。(D)指数関数的成長率が計算され、要約されます。すべてのスケールバー = 5 μm。データは平均±S.D.n=35コロニー(0%)、27コロニー(0.1%)、21コロニー(0.5%)、16コロニー(1%)、13コロニー(5%)、13コロニー(10%)、29コロニー(21%)として表されます。このフィギュアは15から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig4.jpg"> 
図4:振動する酸素条件下での 大腸菌 の培養。 さまざまな振動酸素条件下での細胞増殖を調べます(T'、好気性条件と嫌気性条件の切り替え間隔)。 Aコロニー に基づく細胞増殖は経時的にプロットされ(上)、 μΔtは経時的にプロットされ、時間分解されたデータの解釈を可能にします(下)。データは平均±S.D.n=5コロニー(60分)、3コロニー(30分)、4コロニー(10分)、4コロニー(5分)、4コロニー(2分)、5コロニー(1分)で表されます。このフィギュアは15から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig5.jpg"> 
図5:振動する酸素条件下で培養された大腸菌の単一細胞領域(単一細胞)。データは、各スイッチング間隔T'からの代表的なコロニーからのものである。このフィギュアは15から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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