動物モデルにおける間質液の縦断採取における脳開流微量灌流の利用

私たちは、脳腫瘍間質液中の可溶性シグナル伝達成分を特徴づけており、これらは疾患の進行と治療反応に寄与しています。脳腫瘍間質内の絶対溶質濃度の評価は、高度な実験手法を用いる必要がある研究上の課題です。まず、滅菌メスを使って頭蓋骨の表面に沿って矢状体中央線の切開をし、目の間から尾方に8〜10ミリメートル伸びます。

その後、滅菌鉗子を使って正中切開部から皮膚を横方向に引き戻します。ブレグマとラムダの両方が見えるようにし、必要に応じて切開を延長してください。次に、無菌メスで骨膜を切開し、鉗子で組織を横方向に引き戻します。

滅菌コットン型アプリケーターで1%から3%の過酸化水素を塗布し、頭蓋骨表面を洗浄します。次に、0.3〜1.0ミリリットルのインスリン注射器を使って、20〜40マイクロリットルのセルフエッチング歯科接着剤を頭蓋骨表面に均等に塗布します。その後、歯科硬化ライトに当てて接着剤をエッチングします。

硬化したら、無菌の綿先端アプリケーターと生理食塩水で余分な接着剤を拭き取ります。ドリルビットをcOFMガイド座標に再配置します。ドリルを15,000回転毎分に設定し、DVマイクロマニピュレーターダイヤルでバリ穴を開けます。

掘削中は頭蓋骨の厚さを頻繁に監視し、生理食塩水で洗浄してゴミを取り除き熱を抑えましょう。各アンカースクリュー座標で穴を開けて繰り返します。次に、滅菌ピンセットと滅菌ドライバーを使ってアンカースクリューを取り付け、1〜2本のネジ深さまで挿入します。

その後、cOFMガイドとダミーアセンブリをガイドホルダーに取り付け、ホルダーをステレオタクティックフレームに取り付けます。ガイドチップをバーホールの上に位置させ、ゆっくりと決められた深さに毎分1ミリメートルで下げます。セメント剤を薄く均一な層で頭蓋骨に塗布し、cOFMガイドとネジの上下および周囲に塗布します。

次の層を塗る前に、歯科硬化ライトで各層を硬化させてください。セメントが部品間の全域を覆い、ロックウェッジを避けてください。ガイドホルダーをcOFMガイドから外し、マイクロマニピュレーターのDVノブでゆっくりと持ち上げます。

鉗子を使って、cOFMガイドとダミーアセンブリからロックウェッジを外します。ダミーをガイドから優しく持ち上げます。MLとAPマイクロマニピュレーターのノブを使って、シリンジ注入インサートアセンブリをcOFMガイドに合わせます。

DVノブで注入インサートを下げ、鉗子でロックウェッジをしっかり再挿入して固定します。次に、注射器から細胞懸濁液を1分あたり1マイクロリットルで3マイクロリットル注入します。cOFMガイド周辺を監視し、細胞懸濁液がアセンブリから外れていないか確認してください。

蠕動流体管の部分をマイクロパーフュージョンポンプのポンプヘッドに取り付けます。パーフューセイトバッグをルアーロックコネクターでプッシュチューブに接続します。その後、サンプリングインサートをフランジ付きコネクターでチューブに接続します。

長い入口シャフトをプッシュチューブの出力端に、短い出口シャフトをプルチューブの入力端に接続します。接続されたサンプリングインサートを、750マイクロリットルの人工脳脊髄液を含む無菌マイクロ遠心分離機チューブに入れます。フラクションコレクターニードルをフランジ付きチューブコネクターでプルチューブ出力ラインに接続します。

その後、1分間10マイクロリットルで20分間チューブ洗浄を行い、気泡を除去します。次に、気密注射器を使って人工脳脊髄液をプルチューブラインに事前に充填します。微小灌流ポンプのポンプヘッドに蠕動剤チューブを再取り付けてください。

フランジ付きチューブコネクターでサンプリングインサートを再度接続します。インレットをプルチューブの出力端に接続し、出口をプルチューブの入力端に接続します。インサートを750マイクロリットルの人工脳脊髄液を入った滅菌のマイクロ遠心分離機チューブに入れます。

残留気泡を除去するために、毎分10マイクロリットルでさらに20分間のチュービングシステムを洗浄してください。麻酔をかけた動物を適切なサイズのジャケットに着せます。前肢を完全に腕の穴から引き出し、ジャケットを動物の背中にしっかりと固定します。

鉗子を使ってガイドとダミーのロッキングウェッジを外してください。次に、ダミーインサートを慎重にガイドから持ち上げます。サンプリングインサートをガイドに優しく取り付け、ロッキングウェッジを再度挿入します。

動物を麻酔から外し、回転ケージシステムに入れます。ケージのテザーを動物のジャケットに結びつけ、回転ケージシステムを作動させます。cOFMサンプリング後、回転ケージシステムを無効化し、ケージのテザーを動物のジャケットから外します。

次に鉗子を使って、ガイドとサンプリングインサートのロッキングウェッジを取り外します。慎重にサンプリングインサートをガイドから引き出し、ダミーインサートをそっとガイドに戻し、ロッキングウェッジを再び挿入します。動物のジャケットの背中の留め具を外し、ジャケットを優しく外します。

生物発光イメージングにより、cOFMガイドを媒介した腫瘍細胞移植を受けた動物に腫瘍が存在することが確認されました。cOFMサンプルのプロテオミクス主成分解析により、テモゾロミド処理群とジメチルスルホキシド処理動物群の間に明確な分離が認められました。全域代謝シグナル分布は、テモゾロミドとジメチルスルホキシドサンプル間でほぼ完全に重なり合っていました。

シグナルの重複にもかかわらず、代謝体化火山解析ではテモゾロミド駆動の明確なシフトが明らかになりました。同じ動物の代謝組別値を定量的に比較した結果、再循環構成は相対代謝物比率を維持しつつ分析物濃度を向上させることが示されました。脳腫瘍微小環境内の相対的な栄養利用可能性は依然として十分に解明されていません。

このプロトコルはこのギャップを埋めるために使われています。腫瘍微小環境内の栄養素の利用可能性とシグナル伝達を特徴づけることで、膠質腫の進行および治療に対する適応抵抗のメカニズムを明らかにできます。