異種移植における急性細胞拒絶反応および抗体介質拒絶反応の研究を用いる3人による標準化マウスモデル

私たちの研究は、急性細胞性拒絶反応および抗体介在性拒絶反応のメカニズムを研究するための、標準化された小動物異種移植モデルに焦点を当てています。既存のモデルは、操作者の習熟度によるばらつきや肺の手技に課題があることが多いです。本プロトコルでは、迅速で標準化された、再現性のあるワークフローを提供します。

この図は、術者がレシピエントの準備、ドナー心臓の摘出、およびドナー心臓の吻合を同時に行う、マウス異種移植の標準化された3人体制のワークフローを示しています。まず、生後10〜12日の新生Sprayed Dollyラットと、7〜8週齢のC57BL/6またはBALB/cマウスを用意します。すべてのドナーラットおよびレシピエントマウスを、特定病原体フリー（SPF）環境で飼育してください。

ポビドンヨードを浸したコットンボールを用いて、麻酔をかけたラットの胸腹部を消毒します。ハサミで腹部を切開します。次に、綿棒を使って腸を慎重に脇に寄せ、下大静脈を露出させます。

インスリン用注射器を用いて、ヘパリン化生理食塩水を0.2から0.5 milliliters、下大静脈に注入します。出血を防ぐため、注入部位を脱脂綿で軽く圧迫します。横隔膜を切開します。

胸壁を両側から切開し、心臓を完全に露出させるために牽引します。次に、胸腺を除去し、圧力を軽減するために上大静脈を切断します。心停止を誘発するため、University of Wisconsin溶液を1 mL、大動脈に灌流します。

心臓の色が赤から淡色に変わるまで灌流を続けます。心臓の上に氷冷生理食塩水に浸したガーゼを置き、温度を下げて脱水を防止します。8.0の絹縫合糸を用いて、上大静脈と下大静脈を結紮します。

両方の血管を横切るように切断します。次に、大動脈弓で大動脈を切断します。肺動脈をその分岐点で切断します。

8-Oシルク縫合糸を用いてすべての肺静脈を結紮します。次に、ドナー心臓を摘出します。採取した心臓を氷冷生理食塩水に入れ、一時的に保存します。

除毛クリームを使用して、麻酔下にあるレシピエントマウスの頸部の毛を除去します。ポビドンヨードとアルコールをそれぞれ3回ずつ交互に用い、皮膚を消毒します。外科用メスを用い、頸部正中線から右に約1cmの位置に、2cmの縦切開を加えます。

鈍的剥離を行い、皮下脂肪および筋肉層を除去します。顎下腺を摘出します。外頸静脈を露出させた後、低凝固モードに設定した電気焼灼ペンを使用して、分枝を個別に焼灼します。

結紮のため、静脈の遠位端付近に8.0のシルク縫合糸を2箇所留置します。次に、マイクロサージェリー用鋏を用いて、2つの結紮部位の間で外頸静脈を切断します。外頸静脈を静脈カフに通し、カフを静脈の基部まで押し込みます。

次に、血管クランプで固定します。マイクロサージャリー用ハサミを使用して結紮糸を除去します。その後、ヘパリン生理食塩水を用いて静脈内の残血を洗い流します。

マイクロサージカル鉗子を用いて、外頸静脈をカフの上に反転させ、8.0シルク縫合糸で固定します。胸鎖乳突筋の後方で鈍的に剥離し、頸動脈鞘を同定します。頸動脈鞘を切開します。

総頸動脈を内頸静脈および迷走神経から慎重に分離します。次に、頸動脈を結紮し、切断します。その後、切断した動脈の下端をアーテリアルカフに通します。

動脈をカフの上で反転させ、固定します。ドナーの大動脈を、レシピエントの頸動脈にある動脈カフの上に被せます。8.0 シルク結紮糸で固定します。

ドナーの肺動脈に緩い結び目のループを作成します。肺動脈をレシピエントの外頸静脈の静脈カフに通します。その後、シルクリガチャーで固定します。

受容側の頸動脈と外頸静脈の血管鉗子を外し、血流を再開させます。ドナー心臓が強い収縮を再開し、10秒以内に急速に赤色に変わることを確認してください。ドナー心臓のリズムが安定したら、その位置を調整します。

4.0の縫合糸を用いて、頸部の皮膚切開部を閉鎖します。手術部位をポビドンヨードで消毒します。体温を維持するため、マウスを37～38°Cに保たれた温かく柔らかいパッドの上に置きます。

マウスが意識を取り戻すまで観察します。完全に覚醒した後、十分な餌と水が提供される個別のケージで飼育してください。BALB/cレシピエントにおける移植片の生存期間の中央値は4日でした。

一方、C57 Black 6レシピエントでは、6.5日まで有意に延長しました。SDからBALB/cへの移植群では、ヘマトキシリン・エオジン染色により、広範な赤血球の血管外漏出を伴う重度の心筋破壊が認められました。SDからC57 Black 6への移植群では、ヘマトキシリン・エオジン染色により、主に炎症性浸潤を特徴とする心筋損傷が認められました。

SDからBALB/cへの移植群では、免疫蛍光染色により、CD3陽性T細胞の浸潤およびCD68陽性マクロファージの浸潤は最小限であり、C4Dの広範かつ強度の沈着が認められた。SDからC57 Black 6への移植群では、免疫蛍光染色により、顕著なCD3陽性T細胞の浸潤、中程度のCD68陽性マクロファージの存在、および中程度のC4D沈着が認められた。平均成功率は、1人グループの86.7%に対し、3人グループでは93.3%であった。

チームの相関、習得練習、循環化、および安定した洗練された現代的な基盤を確保することが主な課題です。今後の研究では、この標準化されたモデルを用いて、異種移植の免疫メカニズムを調査し、一般的な免疫抑制または耐性誘導の影響を評価することが可能です。