クローン病様回腸炎および線維症のSHIP欠損マウスモデルにおける治療的介入の評価

SHIP欠損マウスを用いて、クローン病における腸の炎症や線維化のメカニズムを研究し、新薬や治療戦略の評価を行っています。そのため、私たちはこのモデルを前臨床研究で用いて、グリコーゲンIBD薬剤の標的薬物送達の有効性を示してきました。当プロトコルはSHIP欠損マウスを用いており、これらのマウスは自然に回腸炎症や線維化を発症し、従来の化学的誘発や損傷モデルよりも生理学的に関連性の高いモデルを提供します。

本研究の発見は、SHIP欠損マウスを回腸炎および線維化の堅牢なモデルとして確立し、クローン病の治療の機構的研究や前臨床試験を可能にします。まず、アッセイを行う前にマウスを4時間断食させます。4キロダルトンFITCデキストランを滅菌PBSに溶解し、最終濃度80ミリグラム/ミリリットルに到達させます。

次に、マウスを優しく拘束し、経口ガベージからFITCデキストラン溶液150マイクロリットルを投与し、ガベジ後さらに4時間無食のままにします。安楽死後、25ゲージの針と1ミリリットルの注射器を使って心臓穿刺を行い、血液を採取します。直ちに、採取した血液100マイクロリットルごとに抗凝固剤として酸-シトレート-デキストロース溶液10マイクロリットルを加えます。

チューブを何度か逆さまにしてよく混ぜます。採取した血液サンプルを1,500Gで4度の温度で10分間遠心分離します。慎重にプラズマをラベル付き1.7ミリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。

分析の準備が整うまで、すべてのサンプルは氷に保管し、光から遮蔽してください。次に、PBSを使って各血漿サンプルを1対2、1対10の比率で希釈します。各プラズマ希釈を100マイクロリットル不透明な96ウェルプレートに加え、重複ウェルに配置します。

PBSを用いて、元の80ミリグラム/ミリリットルのFITCデキストランを1〜2回連続希釈し、異なる濃度の溶液を調製します。各希釈を100マイクロリットルずつ、96ウェルプレートの複製ウェルに加えます。次に、励起用485ナノメートル、発光用535ナノメートルに設定されたマイクロプレートリーダーを用いて蛍光を測定します。

採血後 FITCデキストラアッセイでは、マウスから小腸全体を慎重に切除します。腸から付着した脂肪や結合組織を優しく取り除きます。きれいにした腸を白い白紙の上に平らに置き、視覚的なコントラストを強めます。

組織を肉眼で調べ、特にSHIPノックアウトマウスの遠位10センチメートルに注目してください。ここで炎症がよく起こります。腸を定規の横に合わせてスケールをつけ、標本全体を写真撮影して重大な病理学的所見を記録します。PBSで腸内腔を優しく洗浄し、注射器で腸内分泌物を除去しつつ、過度な力は避けて陰部構造の歪みを防ぎます。

遠位回腸の主要な病理を最も代表する領域を特定し、約1センチメートルの組織を切除します。切除した組織を組織学カセットに平らに置き、固定時の折りたたみを防ぐために2枚のスポンジの間に挟みます。ヘマトキシリンとエオシン染色、マッソン染色では、組織を10%中性緩衝ホルマリンに固定し、組織体積の10倍から20倍の液体を4度摂氏で一晩固定します。

固定後、カセットを70%エタノールに移して保管し、処理まで完全に浸かるようにします。アルシアンブルーおよび周期酸シフ染色の場合、カルノイ溶液中に組織を4度Cで一晩固定します。固定後、カセットを100%エタノールに移し、処理まで保管します。

その後、固定された組織をパラフィンに埋め込み、5マイクロメートルのスライスに分割して後回染色します。ヘマトキシリンおよびエオシン染色された回腸切片を、定義された組織病理学的基準に基づき16点スケールで採点します。あらかじめ定められた基準に基づく6点スケールでマッソンのトリクロ染色断面を評価します。

実験条件を盲検された2人の独立した査読者が割り当てたスコアの中央値として、最終的な線維症スコアを計算します。組織学サンプルの解離と摘出後、回腸の遠位10センチメートルの残りの部分を採取します。集めた組織を紙タオルや綿毛のないワイプで拭き取り、校正済みの体重計で組織の重さを記録します。

組織を液体窒素で急速凍結し、その後マイナス80度で保存し、今後の処理に備えます。処理の準備ができたら、凍結組織を回収し、常に氷の上で保管してください。その後、組織サンプルを再度重さで正確な質量を確認します。

PBSにプロテアーゼ阻害剤を加えて均質バッファーを準備します。組織1ミリグラムあたり10マイクロリットルのバッファーを使用してください。ベンチトップホモジナイザーを用いて、氷冷均質バッファーで全層回腸組織を均質化します。

均質細胞が均一で組織の断片が見えなくなるまで続けます。交差汚染を防ぐため、サンプル間にはPBSでホモジナイザーチップを十分にすすいでください。遠心分離機で組織を10,000Gで4度摂氏の温度で10分間均質化します。

浄化された上清液を小さな体積に分けて凍結融解のサイクルを防ぎ、その後マイナス80度で保存して将来の分析に備えます。組織学的解析では、SHIP欠損マウスの腸損傷がSHIP対照群と比較して有意に大きいことが示されました。デキサメタゾン治療はSHIP欠損マウスの組織学的損傷を減少させましたが、その減少は統計的に有意ではありませんでした。

マッソンのトリクロム染色では、SHIP欠損マウスのコラーゲン沈着がSHIP対照群と比較して有意に増加し、線維化スコアが高かったことが示されました。デキサメタゾン治療はSHIP欠損マウスの線維化を著しく減少させ、スコアをSHIP陽性対照群に近づけました。アルシアンブルーおよびPAS染色により、SHIP欠損マウスでゴブレット細胞過形成が確認され、デキサメタゾン治療後に目に見えて減少しました。

SHIP欠損マウスではIL-1ベータ濃度がSHIP対照群と比較して有意に上昇していました。デキサメタゾンはSHIP欠損マウスのIL-1β濃度を有意に低下させました。SHIP欠損マウスではMPO濃度がSHIP対照群と比べて有意に高く、デキサメタゾンによってこの増加は減少しましたが、統計的有意には至りませんでした。

SHIP欠損マウスでもLCN-2濃度は上昇しましたが、デキサメタゾンによる高濃度の低下は一貫していませんでした。IL-1ベータ濃度は組織学的損傷スコアや線維症スコアと正の相関を示し、炎症と組織損傷の関連を示しています。組織学的損傷スコアは線維症スコアと正の相関を示し、組織損傷と線維化性再構築が並行して進行していることを示唆しています。