蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル
2025年11月21日
本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。
このマイクロスフィア注入法を用いて、毛細血管塞詰の短期的および長期的な影響を解明し、脳毛細血管ネットワークにおける塞bolusの除去の潜在的なメカニズムを調査することを目指します。これにより、皮質毛細血管ネットワーク内の蛍光粒子のリアルタイムin vivo画像化および追跡が可能になります。マイクロスフィアと局所的な影響は注射後数週間追跡可能です。
私たちの研究は、微小血管閉塞による局所的な組織損傷の理解に役立ちます。これらの結果は、新たな治療戦略につながることが期待されています。私たちは今や、毛細血管の詰まりが血管を変化させ、細胞を活性化させ、血流を変化させ、血脳関門を損傷させる仕組みを日々、そして何週間も研究できるようになりました。
まず、麻酔をかけたマウスの足の指をつまんで麻酔の深さを確認します。下顎の下の気管上から約0.5センチの中央線切開を外科用ハサミと解離鉗子を使って行います。頸筋膜の浅い結合組織を微細縫合鉗子で剥離し、下の胸骨舌骨筋を露出させます。
次に、左右の胸骨舌骨筋を優しく切断して分離します。組織フックで右のオモモヒーイド筋を尾側側に引っ張ります。右の頸動脈三角形(総頸動脈、内頸動脈、外頸動脈を含む)がはっきり見えるようにしてください。
次に、総頸動脈を取り囲む残存する筋膜や脂肪組織を取り除きます。頸動脈総部を迷走神経から慎重に分離してください。総頸動脈の周りに4/0 1.5インチの糸を2本巻き、結び目が血流を妨げないようにゆるく結びます。
内頸動脈および後頭頂動脈から筋膜と脂肪組織を除去します。その後、後頭頂動脈と後頭動脈を含むすべての内頸動脈側枝を、4/0 1.5糸で結び目で結び、一時的に結紮します。外頸動脈と側頭動脈から筋膜と脂肪組織を除去します。
外頸動脈と側頭動脈の周りに4/0サイズの1.5スレッドを使って、2つのゆるい結び目を作ります。最も遠位の糸をY字型分岐部からできるだけ遠くに位置させ、外頸動脈と側頭動脈を永久に結紮します。近接結び目は結ばずにいてください。
10マイクロメートルの微球を均質化し、超音波処理を行い、個々の粒子の均一な懸浮液を得る。均質化されたマイクロスフィア20マイクロリットルをFITCデクトラン140マイクロリットルに加えると、最終体積は1.44×10の5マイクロスフィアの乗数を含む160マイクロリットルの混合物になります。カテーテルに接続された注射器を短く引き抜いてエアロックを作ります。
次に、カテーテルの先端を準備済みのFITCデキストラン/Tween20/マイクロスフィア混合液に浸し、注射器をゆっくり引き戻して混合物がカテーテル内に入るまで続けます。カテーテル内に気泡がないか必ず確認してください。カテーテルを装填したシリンジをシリンジポンプに入れます。
ポンプを10マイクロリットル毎分に設定し、カテーテル先端に微小なミクスフィア混合物の滴ができるまで続けます。次に、内頸動脈に血管クリップを当て、事前に用意した近位結び目の一つを総頸動脈の周りに締めます。マイクロシザーズを使い、結紮線から約0.5ミリメートル先の外頸動脈に小さな斜め切開を行い、切開の大きさがカテーテルの直径よりやや小さくなります。
血液は滅菌布で吸収してください。カテーテル先端にマイクロスフィア混合物の滴を作って、カテーテル先端に空気が残っていないことを確認するために、シリンジポンプを短時間起動します。外頸動脈切開部を開け、細かいマイクロ鉗子でカテーテルを挿入します。
その後、外頸動脈の近位縫合糸を締めてカテーテルを外頸動脈に固定します。動脈が目に見えて拡大し、緑色のFITC染料が外頸動脈を満たすまで徐々にポンプを送り、注射成功を確認します。次に、内頸動脈から血管クリップを外します。
次に、シリンジポンプの流量を毎分20マイクロリットルに上げます。後頭頂動脈分岐部の遠位にある内頸動脈がFITC染料で満たされていることを確認することで、マイクロスフィア注射の成功を確認します。注射が成功したら、総頸動脈を結紮していた糸を外し、マイクロスフィア混合物が内頸動脈に流れるようにします。
注射中、FITC染料は外頸動脈にまだ観察されます。カテーテル内の混合気が80マイクロリットルに達したら注射を止めて注射を止めてください。次に総頸動脈を結紮し、内頸動脈をクリップし、カテーテルを優しく外しつつ、固定糸はそのままにします。
カテーテルを固定していた糸を締めて外頸動脈を永久結紮します。血管クリップと総頸動脈、内頸動脈、後頭頂動脈の周りの糸を外して血流を回復させます。微小血管塞栓症手術の成功は、手術後4日後の全身および全身脳の死後推定画像検査で確認されました。
矢状状脳の断片では脳内の微小球の蓄積が確認されました。手術後1日に摘出したマウス脳の画像検査では、微小球が主に同側半球の中前大脳動脈の流域内に収まっていることが示されました。Tween20をマイクロスフィア混合物に加えると、脳スライス中のマイクロスフィアカウントが有意に増加しました。
マウスはTween20を含むマイクロスフィア混合物を注射すると、体重減少が少なく、手術後の回復も早かった。手術後0.5時間後に撮影した脳皮質の蛍光顕微鏡画像では、毛細血管を閉塞する微小球を表す白い点が個別に見られました。2光子Zスタック投影画像では、微小球が灌流障害を伴う脳微血管塞栓症を引き起こすことが示されました。
塞栓症はまた、血管からの染料漏れによって血脳関門を破壊します。
概要
本プロトコルでは、生体内（in vivo）二光子顕微鏡イメージングに最適化した、慢性頭蓋窓および微小血管塞栓マウスモデルを作成するための詳細なステップバイステップの手法について説明します。この手法では、蛍光ポリスチレン微小球を用いて、毛細血管の閉塞による影響を調査します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 微小血管研究
- in vivoイメージング技術
背景
- 微小血管閉塞の結果を理解することは、新しい治療戦略を開発する上で極めて重要です。
- リアルタイムイメージングにより、脳毛細血管ネットワークにおける蛍光粒子の追跡が可能になります。
- 先行研究により、毛細血管の閉塞が局所的な組織損傷を招く可能性があることが示されています。
- 本研究は、脳内における塞栓除去のメカニズムを解明することを目的としています。
研究目的
- 毛細血管閉塞の短期的および長期的影響を調査すること。
- 微小血管の閉塞が血流および血液脳関門にどのように影響するかを理解すること。
- 微小血管損傷に関連する疾患に対する潜在的な治療戦略を探索すること。
使用した手法
- イメージングのためのマウス慢性頭蓋窓の作製。
- 微小血管塞栓を誘導するための蛍光マイクロスフィアの注入。
- リアルタイムイメージングのための2光子顕微鏡の利用。
- 脳内へのマイクロスフィアの留置を確認するための術後イメージング。
主な結果
- マイクロスフィアは主に同側半球に留まっていました。
- Tween20を添加することで、マイクロスフィア数の増加が観察されました。
- Tween20を注射したマウスは、術後の回復がより速いことが示されました。
- 蛍光顕微鏡により、マイクロスフィアによる毛細血管の閉塞が明らかになりました。
結論
- この手法により、生体内で微小血管閉塞の詳細な研究が可能になります。
- 得られた知見は、脳微小血管疾患の治療戦略に対する新たな洞察につながる可能性があります。
- 本研究は、脳内における血流のダイナミクスと組織損傷に関する理解を深めるものです。
よくある質問
産業界への実用的意義
蛍光マイクロビーズと生体内二光子顕微鏡を用いた微小血管塞栓モデルは、脳微小閉塞のメカニズムと影響を解析するための強固なプラットフォームを提供します。この手法により、血管イベントと組織反応の高解像度な縦断的追跡が可能となり、初期段階の神経血管標的バリデーションにおける予測信頼性を向上させます。本モデルの再現性と定量的なイメージング出力は、神経血管系薬剤探索におけるポートフォリオの優先順位付けおよびメカニズム面でのリスク低減のための貴重な資産となります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 微小塞栓の制御された誘導により、神経血管損傷に関する仮説の検証が可能になります。
- 血管、細胞、および血液脳関門の反応を経時的に可視化することで、メカニズム面でのリスク低減を支援します。
- 塞栓イベントと、それに続く組織損傷およびクリアランス動態を関連付けることで、機能的なターゲット検証を容易にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 微小血管閉塞および再灌流を定量的に評価するための、検証済みin vivoシステムを提供します。
- アッセイの標準化および研究間の比較に適した、再現性の高い高コンテンツのイメージング出力を提供します。
- 塞栓除去または神経血管保護を標的とした介入候補のスクリーニングを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー探索のため、脳微小血管損傷の疾患関連モデルと整合させています。
- 縦断的なアウトカム追跡を可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- 微小塞栓に対する組織および血管反応を定量化することで、リスク調整後の進展決定に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、発見から前臨床に至る連続的なプロセスに組み込まれており、神経血管生物学におけるメカニズム研究とトランスレーショナルリサーチの橋渡しをします。
- 探索生物学： リアルタイムイメージングを用いて、微小血管損傷およびクリアランスメカニズムに関する仮説検証を促進します。
- スクリーニング： 生体内での候補治療薬を評価するための、定量的かつ再現性のあるリードアウトを提供します。
- 分析： 実験群間における塞栓負荷、組織損傷、および回復の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： メカニズム的な知見を、疾患に関連するエンドポイントやバイオマーカーの開発へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 神経血管研究および介入試験のための、標準化され再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経血管ターゲットのバリデーションおよびメカニズムのデリスキングにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値：標準化されたイメージングおよび注入プロトコルにより、再現性とスケーラビリティを向上させる。
- 戦略的価値：血管および組織の転帰に関する定量的かつ縦断的なデータを提供することで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：強固なin vivoエビデンスに基づいた、神経血管プログラムのリスク調整後優先順位付けを支援する。
実施上の注意点
- 顕微手術、in vivo イメージング、および血管イベントの定量分析における専門知識が必要です。
- 2光子顕微鏡および死後3Dイメージングのインフラへのアクセスが不可欠です。
- 再現性を確保するため、注入混合液およびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- さまざまなマウスモデルに適応可能ですが、血管領域に応じて最適化が必要な場合があります。
- 潜在的な制限として、技術的な複雑さと動物の長期的なモニタリングの必要性が挙げられます。
