早期がん検出におけるパーソナライズされたタンパク質コロナプロファイリングのための標準化されたSDS-PAGEワークフロー

私たちはナノ粒子が血液とどのように相互作用して早期がんの兆候を明らかにするかを研究し、シンプルで再現性が高く主に非侵襲的な診断検査を目指しています。まず、グラフェン酸化物ナノシートのストック溶液4ミリグラム/ミリリットルを超純水に希釈し、所望の濃度にします。希釈溶液を28%振幅で2分間ソニック化し、均一な分散を確保するためにパルスを8秒オン・6秒オフに設定します。

分散溶液の濃度を紫外線可視光分光法で定量化します。次に、633ナノメートルのヘリウムネオンレーザーを用いた動的光散乱を用いて溶液の流体力学的サイズとゼータポテンシャルを測定します。QVet検出限度に従って超純水で試料を希釈します。

次に、市販の凍結乾燥されたヒト血漿を必要に応じて超純水で希釈します。再構成されたプラズマを18、620Gで4度摂氏で15分間遠心分離。上澄液を採取し、マイナス80度の温度で保存し、再度使用します。

次に、ビシンコニン酸アッセイを使ってタンパク質濃度を定量し、血漿希釈を調整し、最適なナノ粒子と血漿の比率を決定します。選択されたナノ粒子の体積をプラズマと混合し、両者のターゲット比を実現します。混合物は37度Cで1時間孵育します。

タンパク質コロナを分離するために、ナノ粒子プラズマサンプルを18,620G、摂氏4度で15分間遠心分離します。できたペレットは200マイクロリットルの超純水で洗います。その後、再懸浮させて再び遠心分離機をかけます。

最終洗浄後、ナノ粒子タンパク質複合体の分離の証拠としてコンパクトペレットの存在を確認します。次に、還元剤、ローディングバッファー、水を混ぜて計算されたローディングバッファーの容積に到達させます。ペレットを用意したローディングバッファーに再懸浮させます。

その後、懸液を100度で10分間沸騰させます。沸騰したサンプルを18、620G、4度Cで15分間遠心分離します。上清液を新しいチューブに集めます。

次に、染色されていないバッファーの分子量標準を着色バッファーで希釈してタンパク質ラダーを準備します。トリスグリシンSDSランニングバッファー10倍を1x濃度に希釈します。電気泳動チャンバーは4%から20%の染色フリー勾配ゲルを使って組み立てます。

その後、メーカーが推奨するレベルに達するまで稼働中のバッファーを注ぎます。各井戸に10マイクロリットルのサンプルを注入します。次に、各ウェルに7マイクロリットルのラダーをピペットで注ぎます。

ゲルを室温で約90分間150ボルトで駆動します。ゲル画像はスクリプトと同じフォルダ内にtiffファイルとして保存してください。その後、オープンゲル処理を行います。

mはMATLABで。ゲル画像の名前を画像名として入力してください。次に、1つのラダーレーンのインデックスをインデックスマーカーとして入力します。

台本を実行してください。手順の完了はコマンドウィンドウに示され、画面に4つのウィンドウが表示されます。次に、元のゲル画像を上に、下部に斜めレーン効果の補正をした図1を開いてください。

左補正と右補正の値を修正して補正パラメータを調整します。図2を開けてください。上部には斜めレーン効果を補正した画像と、下部に除去された背景画像が含まれています。

スクリプト内のBKGのpar Xの値を調整して背景除去を調整します。図2では、すべての識別された車線が垂直の白線で示されていることに注目してください。次に、左側に検出されたピーク、右側にRの二乗値を持つ非線形フィットを示すマーカーレーンの強度プロファイルを図3を開きます。

はしごレーンの予想されるバンド数がフィッティング手順で検出されたピークの数と一致しているか再度確認してください。次に、ゲル内の検出されたすべてのレーンの正規化された強度プロファイルを示す図4を開きます。エクスポートパラメータを1に設定すると、強度プロファイルを分子量の関数としてExcelファイルでエクスポートできます。

台本を実行してください。完了後、作業フォルダにExcelシートが作成され、最初の列に分子量の関数として絶対プロファイルと正規化プロファイルが記載されます。次にゲルプロファイルのプロMファイルを開き、スクリプトを実行します。

画面には4つのウィンドウが表示されます。図5を開くと、各レーンの絶対強度プロファイルが上部に、下部に対応する総強度が示されています。図6は各レーンの正規化された強度プロファイルを示しています。

分子量軸はスクリプトで指定された範囲に従って細分化されます。エクスポートデータを1に設定して、絶対積分面積と正規化された積分領域をエクスポートします。台本を実行してください。

完了後、指定された分子量範囲内のエクスポートされた絶対面積および正規化面積を含むスプレッドシートが作業フォルダーに生成されます。最後に、7と8のフィギュアを開けます。これらは各レーンの絶対面積と正規化面積のヒストグラムを、それぞれレーン別と面積別にグループ化しています。

ここで提示するプロトコルは、プラズマで培養後にナノ粒子上に形成されたタンパク質コロナを単離し特徴づけるための標準化かつ再現可能なワークフローを確立します。この手法により、各パーソナライズされたコロナの生物学的に意味があり診断的に関連性の高い特徴を捉えることができる、非常に一貫したSDSページプロファイルが得られます。すべての条件下で得られたSDSページプロファイルは非常に再現性が高いものでした。

プラズマ濃度を5%から50%に増加させることで、SDSページプロファイルの30〜80キロダルトン領域で信号強度が強くなりました。自動ピペッティングのワークフローにより、ほぼ同一の電気泳動プロファイルが得られました。グラフェン酸化物は、その高い表面積と荷電特性に起因する、安定したコロナプロファイルを一貫して生み出しました。

小、中、大のグラフェン酸化物試料のサイズ分布は狭く、重なりがなく、それぞれ100、300、750ナノメートル前後に集中していました。グラフェン酸化物上で形成されたタンパク質コロナのSDSページプロファイルは、サイズを問わず類似していました。異なる希釈間で明確な違いが観察されましたが、血漿濃度が低いほど特定の分子量範囲でより強い帯が現れ、選択的なタンパク質濃縮を示しました。

中間的なプラズマ希釈時には、密度計測プロファイルが疾患特異的な違いを明らかにし、特にPDACサンプルが信号強度を低下した20〜30キロダルトン領域で示されました。SDSページベースのプロファイリングモデルだけで、PDACおよび対照サンプルの両方を83%の精度とバランスの取れた感度・特異度で正しく同定しました。SDSページのコロナプロファイルとCA 19から9レベルを組み合わせた統合診断モデルは、PDAC患者の分類において最高の精度、感度、特異度を実現しています。

私たちは自動化されたワークフロー、非技術ベースの技術、AI駆動のツールを用いてがん診断研究を前進させています。当プロトコルは迅速かつユーザーフレンドリー、WHO準拠で、標準化された再現可能なコロナ指紋を強い診断関連性を持って提供しています。