アミロイドとクロスベータアーキテクチャ

私たちの研究はX線ファイバー回折を用いて、交差ベータアミロイド線維の構造とその分子組織を調査しています。このプロトコルはX線ファイバー回折を用いてクロスベータパターンを確認し、線維構造を明らかにします。このプロトコルにより、アミロイド線維の構造解析が可能となり、交差β組織の確認からさらなる分子詳細の解明まで行えます。

まず、タンパク質やペプチドの線維を整列させ、理想的には繊維軸がすべて平行な束を作ります。キャンドルワックスをホットプレートで溶かして液状化させます。ガラスカッターを使って、1ミリメートルのホウケイ酸ガラス毛細血管を約2〜3センチメートルの長さに切断しました。

切った毛細血管を液体の蝋に軽く浸します。次に、キャピラリーの作用でキャンドルワックスを毛細体内約1〜2ミリメートルまで引き上げます。次にプラチシンを使って、密封された毛細血管をペトリ皿の中で水平に取り付けます。

毛細血管の蝋で満たされた端との間に0.5〜2ミリメートルの隙間を保ちます。ピペットで、2つの毛細血管のワックスで満たされた端の間に10マイクロリットルの線維溶液の滴を慎重に吊るします。ペトリ皿を蓋をしてサンプルをほこりから守り、一晩蒸発させます。

その後、皿を密封して乾燥環境を管理します。ガラス毛細血管内のアミロイド線維を整列させるには、1ミリリットルの注射器をゴムチューブ付きのシリンジを直径0.7ミリメートルのシリコンガラス毛細血管の広い端に固定します。毛細血管内に2〜3センチの線維懸濁液を吸引します。

溶けたワックスで毛細管の片端を封じ、もう片方は蒸発を許すために開けておく。毛細血管を垂直に配置し、乾燥した円盤が形成されるまで乾燥させます。繊維をマットや薄膜状に整列させるには、高濃度の繊維サンプルをガラススライドと蓋の上に置き、その後24時間の自然乾燥を行います。

ファイバーバンドルのストックをゴニオメーターのヘッドに慎重に取り付け、X線ビームが束を通過するように向きを調整します。フィブリルマットサンプルを使用する場合は、X線ビームがマットの縁を通るように向きを合わせてください。交差偏光器を備えた光学顕微鏡で試料を調べ、複屈折を観察します。

試料をファイバー束、マット、円盤のいずれかでX線ビーム内で位置決めます。社内のX線装置やシンクロトロン放射を使って回折パターンを収集します。データ解析を行うには、ファイルをCLEARER回折パターン解析ソフトウェアにアップロードしてください。

回折パターンおよび回折設定に移動し、ピクセルサイズ、X線源、試料から検出器までの距離などの回折設定を入力します。画像処理をクリックして回転させ、回折画像を垂直方向に回転させます。回折パターンにナビゲートし、「センター画像」をクリックして画像を中心に設定する方法で、センタリングモジュールを使います。

子午線軸と赤道軸を定義します。中央に置いた画像は後で分析するために保存してください。次に、子午線と赤道に沿った適切な角度を指定します。

回折パターンをクリックし、その後にラジアリーアベレージモジュールをクリックすると回折信号の位置グラフが作成されます。強度と比べて。回折パターンメニューからピークファインドモジュールに移動し、回折信号を測定し自動的に出力します。

ピークサーチ幅を調整して、ノイズのない真信号を検出します。ズームと測定オプションを使って、回折信号の位置出力をピークファインドで検証します。ユニットセル最適化モジュールを使って、潜在的な単位セル次元を探ります。

強い赤道信号に基づく初期推定値を入力し、セル探索の最小および最大指数を定義します。ポテンシャル単位セルの寸法を計算し、予測された回折信号位置と観測された反射を比較します。データとサンプルに最も適した単位格子を選択します。

分子モデルを構築するには、決定された単位細胞に適合するベータシート配置のペプチドの3次元配列を構築します。対称性に関連するすべての部品が含まれていることを確認してください。次に「回折シミュレーション」をクリックし、「構造」と「構造チェーンジェネレーター」を選んでPDBモデルを読み込みます。

ファイバー軸とビーム軸を割り当て、単位セルの寸法を入力し、立体衝突をチェックします。回折シミュレーションに移動し、「ファイバー回折シミュレーション」をクリックして、PDB座標をファイバー回折シミュレーションモジュールにアップロードしてください。ファイバー軸の方向、ビーム向き、単位セル寸法、X線光源および検出器の設定を入力し、シミュレーションをクリックしてシミュレーションを実行します。

ビーム軸がファイバー軸に垂直であることを確認しましょう。次に「ファイル」に移動し、「名前を付けて保存」をクリックして、シミュレーション設定をHTMLファイルとして保存し、後で編集できるようにします。シミュレートされた回折パターンをRAW形式またはTIFFファイルとして保存してください。

シミュレーションされたパターンと実験的な回折パターンを比較してください。同じ解析ワークフローで回折信号を測定します。これらの値を記録し、実験データと比較してください。

電子顕微鏡写真では、X線ファイバー試料の調製に適した高密度のアミロイド線維がグリッド上に存在していることが示されました。ストレッチフレームアラインドファイバーは、4.76オングストロームの子午線反射と鎖長、シート間隔、プロトフィラメントサイズから赤道方向に生じる特徴的なクロスベータ回折パターンを生み出しました。理想化されたクロスベータ回折パターンにより、子午線および赤道方向の反射が繊維軸に沿った反復間隔に対応することが示されました。

中心のよく揃った回折パターンは対称で、赤道と子午線のピークが位置が重なり合っていました。回折ピークは自動的に検出され、ピーク検出解析を用いてリスト化されました。検出された回折ピークは、妥当な単位格子寸法を特定するために用いられました。

同定された単位セルを用いて構造モデルを作成し、回折シミュレーション前に可視化しました。提案された構造モデルから生成されたシミュレーション回折データは、反射位置と相対強度の両方で実験回折パターンとかなり一致していることを示しました。シミュレーション回折パターンや実験回折パターンを重ねることで、対応する反射の整列性がさらに示されました。

適切な試料アライメントは回折データの品質とそこから得られる情報を決定するため非常に重要です。この研究により、原子分解能の構造モデリングとAFMなど他の構造技術との統合が可能となり、詳細な分子構造の解析が可能になります。