体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

私たちの研究は、VCPまたはp97が複数の異なる病原体に対して細胞質防御者としてどのように作用するかを明らかにします。これにより、VCPまたはp97が治療応用やバイオエンジニアリング戦略に応用できる可能性が解き放たれます。通常の生化学に加え、超分解能顕微鏡、クライオEM、クライオETを用いて、これらの宿主エフェクターが病原体上でどのように組織化して破壊するかを調べています。

まず、ストレプトコッカス肺炎を37度の温度で2つの株で、トッド・ヒューイット酵母培地で2つの株を2つ、2つの菌株で2を培養します。一晩培養液の一部を新鮮なトッド・ヒューイット酵母培地10食分に接種し、37度の温度で5%二酸化炭素と共に600ナノメートルの光学密度が0.4に達するまで培養します。次に、肺炎連鎖球菌培養液900マイクロリットルと50%グリセロール600マイクロリットルを混合し、グリセロールストックをマイナス80度の温度で保存します。

次に、マイナス80度の新ストレプトコッカス肺炎株を解凍し、トッド・ヒューイット酵母培地5ミリリットに完全に接種します。約10の連鎖球菌肺炎細胞の7の乗を取ります。細胞を徹底的に洗浄するには、細菌を反応バッファーに再懸浮させ、21,000Gの遠心分離機で室温で5分間投与します。

ペレットを549の哺乳類細胞溶解液で再懸浮させます。次に、精製されたユビキチンと1ミリモラーのアデノシン三リン酸を加え、27度の環境で1〜2時間培養します。次に、1モル尿素を含む反応バッファーで細菌を1回洗浄し、その後反応バッファーのみでさらに2回洗浄します。

細菌は1%のパラホルムアルデヒドで固定します。固定後、1ミリグラム/ミリリットルのグリシンを含むPBSを細胞に15分間潜伏させます。その後、PBSで2回洗います。

反応バッファー内の他の必要な成分とユビキチンを組み合わせて反応混合物を準備します。反応混合物の総体積を100〜150マイクロリットルに調整します。細菌をユビキチン酵素含有反応混合物に再懸浮させ、27度の温度で2時間培養します。

尿素を含む反応バッファーで細菌を3回洗浄した後、1%のパラホルムアルデヒドで固定します。固定後、1ミリグラム/ミリリットルのグリシンを含むPBSを細胞に15分間潜伏させます。次に、サンプルを3%BSAで27度の温度で1時間培養し、PBSで2回洗浄します。

ユビキチン化された細菌を、通常免疫蛍光アッセイで用いられる濃度よりも高い濃度で調製した一次抗体溶液に再懸濁します。その後、27度で1時間潜伏させます。細菌をPBSで2回洗浄した後、Alexa Fluor 488およびAlexa Fluor 555と結合した対応する二次抗体に再懸浮させます。

次に、約10〜20マイクロリットルの標識済み細菌サンプルをガラススライドにドロップキャストし、DAPI有無にかかわらず5〜10マイクロリットルのマウンティングメディウムを混ぜます。サンプルにカバースリップをかぶせ、ティッシュペーパーで余分な液体を拭き取ります。6つのマイクロモールVCP p97と1つのマイクロモールNPLOC4および1つのマイクロモールUFD-1を組み合わせます。

反応混合物の体積を約90マイクロリットルに調整し、反応バッファーを使用し、氷上で2時間培養します。次に、p97 UFD-1、NPLOC4を含む反応混合物に1〜2ミリモラーのアデノシン三リン酸を加えます。次に、10の汎域連鎖球菌肺炎細胞7の乗と組み合わせ、37度で2時間培養します。

処理直後、反応混合物から10マイクロリットルのアリコートを取り、連続希釈を行います。各希釈液を10〜20マイクロリットルずつ脳心臓注入オーガープレートに塗布します。ゼロアワーから2時間の時間点の間にコロニー形成ユニットを評価してください。

細菌の生存率は、2時間CFUカウントをゼロ時間CFUカウントで割り、100を掛けて計算します。肺炎連鎖球菌の著しいユビキチン化は、哺乳類細胞溶離液または再構成されたE-1、E-2、E-3酵素系で処理された。対照群ではユビキチン化シグナルが見られず、OTUB1曝露時にユビキチン化肺炎鏈球菌が顕著に低下し、K48連鎖ポリユビキチン修飾が確認されました。

線プロファイル解析では、ユビキチンと細菌シグナルの間に完全な重複があり、空間的な共局在が確認されました。三次元再構築により、ユビキチンと肺炎連鎖球菌の信号の空間的重複が確認されました。野生型p97は、その補因子であるUFD1およびNPLOC4と組み合わせた際、細胞溶解液で行われても精製酵素系であれ、ユビキチン化を行っても2時間後に細菌の生存率を10%から20%に低下させました。

ユビキチン化を省略した場合、p97を熱で不活化した場合、または触媒的に不活性なp97 E57 8Q変異体を使用した場合でも細菌の生存能力低下は観察されず、ユビキチン化と活性p97の両方が細菌殺菌に不可欠であることが確認されました。本研究は、宿主E3ユビキチンリガーゼがどのように異なる病原体を修飾し、感染リスクを排除するエフェクター機構を調査するかの扉を開きます。次に、p97またはVCPがどのように調節されるかを探り、さらに抗菌活性を高めるために工学的に解析することを目指します。