バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法
December 12th, 2025
このプロトコルは、フェノールレッドスレッドと液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースのワークフローを用いてヒト涙液サンプルを採取し、涙液のリピドームプロファイルを発見するための独自の臨床プロトコルを説明しています。単純なメチルテル-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール二相分離法により、涙のバイオマーカー発見に高い回収率で迅速な涙脂質抽出が可能となります。
私たちは、将来の涙バイオマーカー発見のために再現可能な涙液リピドミックプロファイルを達成するため、より標準化され操作しやすいフェノール赤糸ベースの方法を確立しました。現在の課題は、シルマーストリップ刺激が起きる一方で、毛細血管は催涙の収集に操作者ごとにばらつきがあることです。これにより、実験報告や研究間比較が妨げられます。
まずは手袋を着用し、作業台を徹底的に消毒してサンプルの汚染を防ぎましょう。フェノールレッド糸を曲げたフックの反対側の端を持ち、曲がったフック部分に触れないように注意してください。被験者に視線を上鼻の方向に向けさせる。
次に被験者の下まぶたを優しく引き下げ、曲げたフック付きのフェノール赤い糸を眼の外側近くの下側頭葉の眼球結膜に差し込みます。次に、被験者に優しく目を閉じ、フェノールの赤い糸が顔の皮膚に触れないように少し頭を前に傾けるように指示します。被験者の下まぶたを再び引き下げ、フェノールの赤い糸を優しく取り除き、サンプル部位との接触を避けます。
サンプリングされた赤色領域の長さを記録します。そして滅菌鉗子を使って、PRTを新しいサンプルチューブに移す。次に、サンプルチューブに正しくラベルとキャップを付けます。
採取した長さが50ミリ未満の場合は、被験者に1〜3分間休ませ、同じ目で涙液の採取を繰り返します。新たに採取したPRTをそれぞれ別のサンプルチューブに入れます。メタノールと清潔な紙拭きを使い、手袋や鉗子を徹底的に洗浄して、涙の残留物や汚染物質を取り除いてください。
その後、完全に自然乾燥させます。すべてのサンプルチューブはパラフィルムで密封し、一時保存はマイナス20度、長期保存はマイナス80度で即座に保管してください。フェノールレッド糸を処理する前に、マイクロハサミと鉗子をメタノールで事前に洗浄してください。
フェノールの赤い糸から最初の約3ミリの曲がったフックの端を切り落とします。サンプル領域をフェノールレッド染料の前面まで2ミリメートルの断片に切り分け、清潔な1.5ミリリットル有機溶媒耐性マイクロ遠心分離機チューブでこれらの区間を採取します。曲がったフックエンドとPRTの不要な部分は捨ててください。
抽出前にサンプルを氷に置き、低温を保ちます。次に、各サンプルに氷の冷たい質量分析用メタノールを232マイクロリットル加え、15秒間ボルテックスして十分に混合します。サンプルを予備冷却された超音波洗浄器で15分間超音波処理します。
次に、各サンプルにHPLCグレードのメチルテル-ブチルエーテルを774マイクロリットル、脱イオン水194マイクロリットルを加えます。溶剤を十分に混ぜるために15秒ほど渦を巻き込みます。サンプルを再び超音波洗浄液で超音波洗浄液でさらに15分間ソニック処理します。
超音波処理後、サンプルを4度の温度に設定し、毎分1,200回転で8時間振るサーモミサーで培養します。その後、混合物を室温で10分間、手つかずせずに置きます。混合物を10,000Gで4度Cで10分間遠心分離します。
遠心分離後、混合物が目に見えて2つの異なる液体相に分かれていることを確認してください。脂質を含む上部有機相を700マイクロリットル慎重に採取し、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。残留メチルテル-トルブチルエーテルとメタノールを含む下部水相は有害な化学廃棄物として廃棄します。
脂質抽出物は、冷蔵のSpeedVac濃縮器で4度Cに設定して4時間乾燥させます。乾燥脂質抽出物は短期保存時はマイナス20度、長期保存時はマイナス80度で保存します。メタノールとクロロホルムを1対1の体積比で混合してメタノールとクロロホルムの溶媒混合物を準備します。
乾燥脂質抽出物を氷のように冷やしたメタノール・クロロホルム溶媒混合物50マイクロリットルで再合成します。再構成した溶液を予冷の超音波洗浄液で15分間超音波処理します。次に、再構成された脂質抽出物を14,000G、4度Cで10分間遠心分離します。
得られた上清液40マイクロリットルを慎重にガラスインサート付きのオートサンプラーガラスバイアルに移します。液体クロマトグラフィーのタンデム質量分析のために、スリットのないセプタムオープンキャップでバイアルをしっかりキャップします。厳格な基準を用いて、レプリケート1、レプリケート2、リプリケート3の標本群でそれぞれ773、890、1,025種のユニークな脂質種が同定されました。
陽イオンモードでは、26%グレードA、13.2%グレードB、60.8%グレードCの脂質種が1,302種同定されました。ネガティブイオンモードでは、約8.2%グレードA、22.9%グレードB、68.9%グレードCの脂質種が257種同定されました。貯蔵に関する変動があったにもかかわらず、3つのサンプルセットすべてで394種のユニークな脂質種が一貫して同定されました。
3回の訪問における被験者間変動係数は、正モードで21.5%、陰性モードで31.3%でした。このプロトコルは、再現可能な涙液リピドミクス解析のための標準化されたワークフローが存在しない問題を補い、研究間の比較可能性を高めることができます。PRTベースの方法は刺激を最小限に抑え、迅速な涙液収集を可能にし、操作者の変動性を減らします。
今後の研究では、大規模なコホートにおける裂痕リピドミクスバイオマーカーの検証と、個別診断のためのマルチオミクスの統合を目指します。
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概要
このプロトコルは、フェノールレッドスレッドを使用して人間の涙液サンプルを収集するための標準化された方法を概説し、涙液リピドーミクス研究における再現性を高めることを目的としています。このワークフローには、脂質の抽出と分析のための液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）が組み込まれています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 臨床研究
背景
- 現在の涙液収集方法はしばしば刺激や変動につながります。
- 標準化は信頼性の高いバイオマーカー発見にとって重要です。
- フェノールレッドスレッドは涙液採取のためのより侵襲性の低い代替手段を提供します。
- LC-MS/MSはリピドーミクス分析のための堅牢なプラットフォームを提供します。
研究の目的
- 涙液リピドーミクスプロファイリングの再現性のある方法を確立すること。
- オペレーターの変動を最小限に抑え、研究間の比較可能性を向上させること。
- 涙液脂質バイオマーカーに関する将来の研究を促進すること。
使用された方法
- フェノールレッドスレッドを使用した涙液サンプルの収集。
- 二相分離法を使用した脂質の抽出。
- LC-MS/MSによる脂質種の分析。
- 安定性のための管理された温度でのサンプルの保存。
主要な結果
- ポジティブイオンモードで1,300以上の脂質種の同定。
- サンプル全体で394のユニークな脂質種の一貫した同定。
- ポジティブモードで21.5%の被験者間の変動性。
- この方法はリピドーミクス研究の再現性と比較可能性を向上させます。
結論
- フェノールレッドスレッド法は刺激と変動性を減少させます。
- 標準化されたワークフローは涙液リピドーミクス分析の信頼性を向上させます。
- 将来の研究はより大規模なコホートでの脂質バイオマーカーの検証に焦点を当てます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
