バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法

私たちは、将来の涙バイオマーカー発見のために再現可能な涙液リピドミックプロファイルを達成するため、より標準化され操作しやすいフェノール赤糸ベースの方法を確立しました。現在の課題は、シルマーストリップ刺激が起きる一方で、毛細血管は催涙の収集に操作者ごとにばらつきがあることです。これにより、実験報告や研究間比較が妨げられます。

まずは手袋を着用し、作業台を徹底的に消毒してサンプルの汚染を防ぎましょう。フェノールレッド糸を曲げたフックの反対側の端を持ち、曲がったフック部分に触れないように注意してください。被験者に視線を上鼻の方向に向けさせる。

次に被験者の下まぶたを優しく引き下げ、曲げたフック付きのフェノール赤い糸を眼の外側近くの下側頭葉の眼球結膜に差し込みます。次に、被験者に優しく目を閉じ、フェノールの赤い糸が顔の皮膚に触れないように少し頭を前に傾けるように指示します。被験者の下まぶたを再び引き下げ、フェノールの赤い糸を優しく取り除き、サンプル部位との接触を避けます。

サンプリングされた赤色領域の長さを記録します。そして滅菌鉗子を使って、PRTを新しいサンプルチューブに移す。次に、サンプルチューブに正しくラベルとキャップを付けます。

採取した長さが50ミリ未満の場合は、被験者に1〜3分間休ませ、同じ目で涙液の採取を繰り返します。新たに採取したPRTをそれぞれ別のサンプルチューブに入れます。メタノールと清潔な紙拭きを使い、手袋や鉗子を徹底的に洗浄して、涙の残留物や汚染物質を取り除いてください。

その後、完全に自然乾燥させます。すべてのサンプルチューブはパラフィルムで密封し、一時保存はマイナス20度、長期保存はマイナス80度で即座に保管してください。フェノールレッド糸を処理する前に、マイクロハサミと鉗子をメタノールで事前に洗浄してください。

フェノールの赤い糸から最初の約3ミリの曲がったフックの端を切り落とします。サンプル領域をフェノールレッド染料の前面まで2ミリメートルの断片に切り分け、清潔な1.5ミリリットル有機溶媒耐性マイクロ遠心分離機チューブでこれらの区間を採取します。曲がったフックエンドとPRTの不要な部分は捨ててください。

抽出前にサンプルを氷に置き、低温を保ちます。次に、各サンプルに氷の冷たい質量分析用メタノールを232マイクロリットル加え、15秒間ボルテックスして十分に混合します。サンプルを予備冷却された超音波洗浄器で15分間超音波処理します。

次に、各サンプルにHPLCグレードのメチルテル-ブチルエーテルを774マイクロリットル、脱イオン水194マイクロリットルを加えます。溶剤を十分に混ぜるために15秒ほど渦を巻き込みます。サンプルを再び超音波洗浄液で超音波洗浄液でさらに15分間ソニック処理します。

超音波処理後、サンプルを4度の温度に設定し、毎分1,200回転で8時間振るサーモミサーで培養します。その後、混合物を室温で10分間、手つかずせずに置きます。混合物を10,000Gで4度Cで10分間遠心分離します。

遠心分離後、混合物が目に見えて2つの異なる液体相に分かれていることを確認してください。脂質を含む上部有機相を700マイクロリットル慎重に採取し、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。残留メチルテル-トルブチルエーテルとメタノールを含む下部水相は有害な化学廃棄物として廃棄します。

脂質抽出物は、冷蔵のSpeedVac濃縮器で4度Cに設定して4時間乾燥させます。乾燥脂質抽出物は短期保存時はマイナス20度、長期保存時はマイナス80度で保存します。メタノールとクロロホルムを1対1の体積比で混合してメタノールとクロロホルムの溶媒混合物を準備します。

乾燥脂質抽出物を氷のように冷やしたメタノール・クロロホルム溶媒混合物50マイクロリットルで再合成します。再構成した溶液を予冷の超音波洗浄液で15分間超音波処理します。次に、再構成された脂質抽出物を14,000G、4度Cで10分間遠心分離します。

得られた上清液40マイクロリットルを慎重にガラスインサート付きのオートサンプラーガラスバイアルに移します。液体クロマトグラフィーのタンデム質量分析のために、スリットのないセプタムオープンキャップでバイアルをしっかりキャップします。厳格な基準を用いて、レプリケート1、レプリケート2、リプリケート3の標本群でそれぞれ773、890、1,025種のユニークな脂質種が同定されました。

陽イオンモードでは、26%グレードA、13.2%グレードB、60.8%グレードCの脂質種が1,302種同定されました。ネガティブイオンモードでは、約8.2%グレードA、22.9%グレードB、68.9%グレードCの脂質種が257種同定されました。貯蔵に関する変動があったにもかかわらず、3つのサンプルセットすべてで394種のユニークな脂質種が一貫して同定されました。

3回の訪問における被験者間変動係数は、正モードで21.5%、陰性モードで31.3%でした。このプロトコルは、再現可能な涙液リピドミクス解析のための標準化されたワークフローが存在しない問題を補い、研究間の比較可能性を高めることができます。PRTベースの方法は刺激を最小限に抑え、迅速な涙液収集を可能にし、操作者の変動性を減らします。

今後の研究では、大規模なコホートにおける裂痕リピドミクスバイオマーカーの検証と、個別診断のためのマルチオミクスの統合を目指します。