ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過処理の生細胞イメージング
2025年11月14日
このプロトコルは、リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出する蛍光プローブを利用して、ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過性をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。
本プロトコルは、リソソーム膜の完全性および酸性化の変化を検出する蛍光プローブを用いて、ネクロトーシス中のリソソーム膜の透過化を監視する生細胞イメージング法を記述します。この分野の課題は、細胞死過程で損傷したオルガネラの動態を特徴づけ、この損傷がどのように細胞死を引き起こし、または関与するのかを正確に定義することです。まず、抗生物質補充DMEM培地2ミリリットルに5,000個の細胞を無菌ガラス底皿にプレートします。
皿を37度の温度に設定し、5%二酸化炭素で培養し、一晩培養します。デキストラングリーンビーズ20マイクロリットルを、新鮮な抗生物質補給DMEM培地に25マイクログラム/ミリリットルに加えて希釈します。皿から古い培地を取り除き、牛肉を含むDMEM培地を2ミリリットル追加で補完します。
皿を37度のインキュベーターに5%二酸化炭素で設定し、24時間培養してビーズがリソソームに内部化するのを待つ。次に、1ミリモラーのライソトラッカーストック溶液を2マイクロリットル、新鮮なDMEM培地2ミリリットルに加えます。古い媒体をこの染色液に置き換えてください。
細胞を37度の温度で5%二酸化炭素とともに2時間培養します。パソコン、顕微鏡、スキャナー電源、レーザー出力、レーザー発光、ライカ電源をオンにして共焦点システムの部品を起動します。温度コントローラー「キューブ」や「ブリック」と呼ばれる二酸化ガスミキサーコントローラーを含む環境制御をオンにしてください。
二酸化炭素と酸素供給を開けろ。温度調節器を37度に設定してください。ガスと湿度のコントローラーを2酸化炭素5%、湿度95%に設定してください。
イメージングチャンバーを組み立てろ。染色後、細胞を2ミリリットルのPBSで3回洗浄し、その後2ミリリットルの新鮮なDMEM補足培地を加えます。イメージング前に対物レンズに浸漬油を塗ります。
アンテナを顕微鏡ステージに取り付けます。レーザー強度を最大3%(最大5%以下)まで調整し、顕微鏡ソフトウェアで検出器の利得を調整して信号を最適化します。背景を最小限に抑えるにはコントラストバーを調整しましょう。
未処理細胞の基準画像を取得し、これが対照条件となります。プレートを層流フードに戻し、細胞死誘導剤を補足した1ミリリットルの抗生物質DMEMを追加します。取得ソフトでモードをXYTに設定し、512×512にフォーマット、速度を400に、ズームを3に、ライン平均を1に、ラインアベリションを3に、フレーム蓄積を1に、時間間隔を3分に、持続時間を8時間にし、オートフォーカスを有効にしてください。
タイムラプスの取得を開始するには開始ボタンをクリックしてください。初期画像検査で、LysoTrackerの安定した点と蛍光標識デキストランの存在が確認され、治療前にリソソームが完全な状態であることが示されました。TSZ治療から4時間後、LyoTracker蛍光は著しく減少し、デキストランは拡散した細胞質分布を示し、初期のリソーム膜透過性を示しました。
治療から8時間後にはLysoTrackerのシグナルはほぼ完全に消失し、多くの細胞は緑色のデキストラン脈点を保持し、緑色の細胞質シグナルが拡散していました。我々は、死死誘導を行っている生細胞において、リソソーム膜の浸透作用が直接可視化できることを示しました。このプロトコルは、LysoTrackerとデキストランビーズの両方を組み合わせることで、リソソームpHと貨物放出をリアルタイムで同時に監視できることを示しています。
この生細胞画像プロトコルの進展において重要なのは、小さなpH変化やリソソーム膜の透過化をリアルタイムで監視できることであり、フローサイトメトリーや単分子層染色などのエンドポイント解析では見逃されがちな動的イベントを捉えられる点です。
概要
このプロトコルは、ネクロプトーシス中のリソソーム膜の透過性変化をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出するために蛍光プローブを利用します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 神経科学
- 生細胞イメージング
背景
- 細胞死の際のオルガネラ損傷の特徴づけは極めて重要です。
- リソソームの損傷が細胞の死滅にどのように寄与するかを理解することは課題です。
- 生細胞イメージングにより、細胞プロセスのリアルタイム観察が可能になります。
- 蛍光プローブはリソソームの完全性とpHの変化を示すことができます。
研究目的
- リソソーム膜の透過性をモニタリングする方法を開発すること。
- ネクロプトーシス中のリアルタイムの変化を視覚化すること。
- 細胞死におけるリソソームダイナミクスの理解を深めること。
使用した方法
- 抗生物質添加DMEM培地中での細胞プレートとインキュベーション。
- リソソームの視覚化のためのLysoTrackerとデキストランビーズによる染色。
- 時間経過に伴う細胞の変化のイメージングのための共焦点顕微鏡。
- リソソームの完全性とpHをモニタリングするためのタイムラプス撮影。
主要な結果
- 初期のイメージングでは、ネクロプトーシス誘導前の安定したリソソームが示されました。
- 処理後、リソソーム膜の透過性が観察されました。
- リアルタイムモニタリングにより、リソソームpHと貨物の放出の変化が明らかになりました。
- この方法により、エンドポイント分析では見逃される動的な細胞イベントの捕捉が可能になります。
結論
- このプロトコルは、ネクロプトーシス中のリソソーム膜の変化を効果的に視覚化します。
- LysoTrackerとデキストランビーズの組み合わせにより、包括的な洞察が得られます。
- このアプローチは細胞死メカニズムの研究を進展させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Real-time live-cell imaging of lysosomal membrane permeabilization (LMP) during necroptosis addresses a critical gap in understanding regulated cell death mechanisms relevant to target validation and mechanistic de-risking. This approach enables precise temporal mapping of organelle dysfunction, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Integrating dynamic LMP monitoring informs portfolio decisions by clarifying cell death pathways and potential intervention points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of lysosomal dysfunction as an early necroptosis event.
- Supports mechanistic de-risking by linking LMP to downstream cell death outcomes.
- Improves predictive confidence in target engagement and pathway interrogation.
- Facilitates triage of targets based on real-time functional readouts.
Screening & Assay Development
- Provides validated live-cell systems for quantitative assessment of lysosomal integrity.
- Enables reproducible, scalable imaging assays for compound screening.
- Delivers standardized, multiplexed readouts of pH changes and cargo release.
- Supports robust evaluation of candidate modulators affecting necroptosis pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic cell death markers with disease-relevant models when applicable.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of cell death mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying intervention windows and biomarker dynamics.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This live-cell imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic assessment of organelle integrity and cell death progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the sequence and causality of necroptosis events.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides real-time measurements of lysosomal pH and cargo release for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when disease relevance is established.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse cell death and organelle integrity studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on dynamic functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and environmental controls.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis.
- May require adaptation for different cell types or disease models.
- Limited by the need for real-time imaging infrastructure and fluorescent probe compatibility.
