表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G⁺ 外芽外栄養芽細胞の精製

このプロトコルは、ヒト胎盤組織から一次栄養膜を精製し、健康な妊娠中および病理的条件下での機能的特性および免疫学的特性を研究することを目的としています。このプロトコルは、一次ヒト外栄養圏の生存可能性という従来の制限を克服するための再現可能なプラットフォームを提供します。このプロトコルは、その生存可能性と純度を高めるために最適化されています。

まずはヒト胎盤サンプルを取得します。胎盤を胎児側が上向きにして、臍帯挿入部位が見えるように置きます。羊膜を外側膜からへその付着部に向かって手動で剥がし、取り除いてください。

その後、ハサミで羊膜を切り取り捨てます。絨毛膜を胎盤の基部から上へ2インチのストリップに切り分け、それぞれの帯を胎盤に固定したまま保ちます。脈絡膜の帯を2本の指にかけ、12本の側を上に向けて置きます。

無菌の湾曲先端鉗子を使い、母体のデシドゥア・パリエタリスを絨毛膜から優しくこすり取る。20ミリリットルのPBSを含む50ミリリットルの円錐形チューブにデシドゥア・パリエタリスを採取し、リンパ球の分離を行います。次に絨毛膜を、20ミリリットルの洗浄媒体Aを含む別の50ミリリットルの円錐形管に集めます。ハサミを使って、50ミリリットル管内の絨毛膜を2平方ミリメートル未満の小片に切ります。

チューブからウォッシュメディウムAを捨てます。組織をPBSで繰り返し洗浄し、上清液が透明になるまで続けます。胎盤剥離の場合は、母体側を上に向けて胎盤を置き、血栓を取り除きます。

滅菌ハサミを使い、壊死、石灰化、または虚血部位を避けつつ胎盤の基底板を切り取る。絨毛を上向きに指に置きます。次にハサミで慎重に絨毛を除去し、薄い絨毛層だけが残る2〜3ミリの膜を作ります。

デシドゥア基底組織を50ミリリットルの円錐形チューブに20ミリリットルのPBSを収めます。次に、組織を2平方ミリメートル未満の小さな塊に刻みます。次に、PBSをチューブから外します。

デシドゥア基底部をPBSで繰り返し洗浄し、上澄液が透明になり血が見えないまで続けます。次に、15ミリリットルの組織懸濁液を2本の50ミリリットルの円錐形チューブに分割しました。すべてのチューブにPBSを充填してください。

チューブを200Gで1分間遠心分離し、上清液を流します。温かい組織消化酵素カクテル150ミリットルを300ミリリットルのガラスボトルに入れます。ボトルに絨毛膜を30ミリリットル加えます。

20ミリリットルの温かいDMEM/F-20と80ミリリットルの温かい組織消化酵素カクテルを、2本の別々の300ミリリットルのガラス瓶に加えます。次に各ボトルに7.5ミリリットルのデシドゥア・バサリスを加えます。ボトルを水浴で孵化させます。

15分間の孵化期間中は、すべての哺乳瓶を3〜4分ごとに振ってください。消化後、組織を40メッシュサイズの金属篩でろ過します。次に、洗うミディウムBを加えて組織をすすいでゼラチン状の物質を溶かします。

消化していない組織をガラス瓶に戻し、繰り返し消化を行います。次に、セルの懸浮液を100マイクロメートルのフィルターでろ過し、ラベル付き50ミリリットルの円錐形管に入ります。最初の消化と二次消化の細胞は分けて保管してください。

次にセル懸濁液を650Gで8分間遠心分離します。上清液は捨てる。同じ組織の種類と消化数のペレットを1本のチューブにまとめます。

その後、最大25ミリリットルのウォッシュメディウムBでボリュームを補います。組織の種類と消化数がラベル付けされた50ミリリットルの円錐管4本に12ミリリットルのフィコールを加えます。セルサスペンションを慎重にフィコールに重ねてください。

その後、800Gで室温で20分間遠心分離機で壊れずに行います。フィコール培地界面で細胞層を慎重に吸引し、きれいな標識チューブに移してください。次にチューブに洗浄メディウムBを入れ、650Gで遠心分離機で8分間かけてからペレットを再び懸浮させます。

再懸濁したペレットを、組織の種類と消化番号がラベル付けされた滅菌蛍光活性化細胞選別管に入れます。抗CD45 BV785抗体、抗HLA GAPC、抗EGFR1 BV711抗体を加えます。暗闇の中、室温で20分間孵育します。

細胞を洗浄して洗浄培地Bに再懸濁させた後、すぐに40マイクロメートルのセルストレーナーに通します。CD45陰性HLAG陽性、EGFR陽性、陽性の胞外栄養腺を1ミリリットルのEVT培養培地Aを含むチューブに並べ替え。系統マーカーのフローサイトメトリー解析により、4日目まで有効な原発絨毛外栄養芽培養が認められました。一次絨毛膜および下部胸骨HLAG陽性の代表的な光顕微鏡画像を、培養24時間、48時間、72時間後に撮影しました。

絨毛外栄養層は多型HLACおよび免疫抑制共抑制分子を発現させました。外毛膜栄養層はHLAC、PD-L1、PD-L2、HLA-Eの発現を増加させましたが、活性化リンパ球と共培養した72時間ではPVRおよびB7H3の発現は増加しませんでした。活性化リンパ球との共培養後、絨毛外栄養芽細胞死の増加は観察されませんでした。

このプロトコルにより、科学者たちは一次外栄養芽細胞を多様なアッセイに使うことが可能になります。その利点は、細胞培養、コールド培養、フローサイトメトリー、プロテオミクス、トランスクリプトミクスなど、これらの非常に優れた高収量の絨毛外栄養球を用いた分析を可能にする高い生存率です。私たちのプロトコルで最も重要な点の一つは、新鮮な胎盤材料を使うことです。

冷蔵保存はできません。栄養芽細胞は死ぬのが大好きなので、出産後できるだけ早く、できれば出産後2時間以内に胎盤組織を入手し、常温で保管してください。これは非常に生存性の高い外栄養圏を得るために非常に重要です。

したがって、これらの一次栄養圏を活用できる、より高度な革新的な方法の一つが長期細胞培養です。したがって、これらを使って一次4日間細胞培養を確立することができます。そのため、細胞は最大96時間生存可能で、かなり長い時間です。これによりT細胞やNK細胞のような免疫細胞を用いた冷培養が可能です。

もう一つの革新は、青木氏が最初に説明した手法を用いて栄養圏様細胞株を確立できることであり、私たちはこれらの培養菌に応用して長期的に増殖する細胞タイプを確立し、ゲノム編集やその他のより長期的な培養アッセイに活用できるようになったことです。これらの革新的な手法、特に長期細胞培養を用いることで、ゲノム編集、ノックアウト、ノックイン遺伝子、タンパク質を適用し、トロホブラストの一部を過剰発現させて、これらのトロホブラストがどのように耐性を強制するか、免疫や細胞毒性を高めるかを詳細に理解できる長期的なメカニシスカルチャーの設計に大いに役立つと思います。