Name: 表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G+ 外芽外栄養芽細胞の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶヒト胎盤組織からのHLA-G⁺外芽外栄養芽細胞の精製法。FACSによる高純度分離と流式細胞計測による表現型解析により、妊娠合併症の免疫学的メカニズムを解明する。

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<ol><li>Papuchova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+that+have+distinct+immune+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).</li>
<li>Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+primary+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+and+HLA-G%2B+EVT-like+cell+lines+to+study+maternal-fetal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).</li>
<li>Tilburgs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts%3A+Immune-activating+cells+that+interact+with+decidual+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progestogen-driven+B7-H4+contributes+to+onco-fetal+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance.</a> Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+human+leucocyte+antigen-C+molecules+at+the+surface+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells.</a> Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Moffett, A., Loke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+placentation+in+eutherian+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of placentation in eutherian mammals.</a> Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).</li>
<li>Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+role+of+HLA-C+in+tolerance+and+immunity+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface.</a> Front Immunol. 10, 2730(2019).</li>
<li>Vander Zwan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+signature+of+activation+and+dysfunction+allows+human+decidual+CD8%2B+T+cells+to+provide+both+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).</li>
<li>Salvany-Celades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+functional+regulatory+T+cells+control+T+cell+responses+at+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface.</a> Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).</li>
<li>Mahajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+decidual+CD8%2B+T+cells+include+distinct+effector+memory+and+tissue-resident+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells.</a> JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).</li>
<li>Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KIR2DS1+by+decidual+natural+killer+cells+increases+their+ability+to+control+placental+HCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-eclampsia%3A+Pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications.</a> BMJ. 366, 12381(2019).</li>
<li>Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+T+cells+in+decidua+of+miscarriage+cases+with+abnormal+or+normal+fetal+chromosomal+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content.</a> J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+decidual+effector+regulatory+T+cells+increase+in+late+gestation+of+normal+pregnancy+but+not+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia.</a> Front Immunol. 9, 1934(2018).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+heterogeneity+in+gestational+age+and+preeclampsia+using+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing.</a> Front Immunol. 15, 1401738(2024).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+signatures+of+the+human+placenta+in+term+and+preterm+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition.</a> eLife. 8, e52004(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+developmental+deficiencies+in+placentation+and+decidualization+in+late-onset+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia.</a> Front Immunol. 14, 1142273(2023).</li>
<li>Morita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+repertoire+and+PD-1+expression+in+decidual+and+peripheral+CD8%2B+T+cells+reveals+distinct+immune+mechanisms+in+miscarriage+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia.</a> Front Immunol. 11, 1082(2020).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proportion+of+peripheral+blood+and+decidual+CD4%2B+CD25bright+regulatory+T+cells+in+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia.</a> Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).</li>
<li>Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+and+peripheral+blood+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+early+pregnancy+and+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion.</a> Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).</li>
<li>Shannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+assessment+of+primary+and+stem+cell-derived+human+trophoblast+organoids+as+placenta-modeling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms.</a> Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).</li>
<li>Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
<li>Okae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+trophoblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of human trophoblast stem cells.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+in+human+trophoblast+stem+cells+reveals+shared+and+distinct+aspects+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+stem+cell-based+organoid+models+of+the+human+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.</a> Nat Commun. 15 (1), 962(2024).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&nbsp;&deg;C freezer</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 5% CO2 Incubator</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C fridge</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &frac12;&rdquo; scissors</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Viability Staining Solution</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&nbsp;&deg;C freezer&nbsp;</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700, mouse, IgG1 k Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot Spectral Cell Sorter</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 biosafety cabinet</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 Mouse IgG1, &kappa; isotype Control&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation sieve</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CD1-1KT (mesh size 60)</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers 40&micro;m, 70&micro;m, 100&micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 Green Detection Reagent</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Curved tip tweezers</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF, Human, Recombinant, Animal Free</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin (1mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>magnet separator</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10X Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>Research grade FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542. 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath 37&nbsp;&deg;C</td><td>どの供給業者でも</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x No Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza</td><td>04-380Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのhla-g+ 外芽外栄養芽細胞の精製

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

期待セルの収率
15 mLのデシドゥア・バサリスから、期待されるHLA-G+ EVTは、最初の消化で106 細胞×0.1-0.3、2回目の消化で106 細胞×0.1-0.6(合計0.2-0.8 ×10 6 細胞)を得ます。絨毛膜30 mLからの期待されるHLA-G+ EVT収量は、最初の消化で106 細胞×0.4-1.0、2回目の消化で106 細胞×0.4-1.5(合計0.8-2.5 ×6 細胞)です。分離株中のカスパーゼ3/7-7-AAD-生EVTの割合は90〜95%と予想されています。
一次HLA-G+ EVT培養
系統マーカー(HLA-G、HLA-C、EGFR)および細胞死マーカーのフローサイトメトリー解析により、このプロトコルは選別されたEVTをプレート化してから4日目(96時間後)まで有効な一次EVT培養を提供したことが示されました(図1B-D)。一次絨毛膜およびd. basalis HLA-G+ EVTの代表的な光学顕微鏡画像は、培養24時間、48時間、72時間後に示されます(図2A-F)。
一次HLA-G+ EVTとT細胞の共培養
このプロトコルにより、胎盤からの隔離後96時間で一次性EVTの生存率が向上し、前回の報告1、2、10と比較して改善されました。したがって、母体と胎児の界面における急性炎症を模倣する、前刺激リンパ球との共培養後のEVT応答の解析を可能にします。EVTは細胞外フローサイトメトリー染色により、多型HLA-CおよびPD-L1、PD-L2、PVR(CD155とも呼ばれる)、B7H3、HLA-Eなどの免疫抑制共抑制分子を発現します(図3A,B)。EVTはHLA-CおよびPD-L1、PD-L2、HLA-Eの発現を増加させましたが、プロトコルセクション8(図4A、B)に従い、活性化リンパ球と共培養した際にはPVRおよびB7H3の発現は増加しませんでした。さらに、7AADおよびカスパーゼ3/7染色(図4C,D)でEVT死亡の増加は観察されませんでした。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
図1。培養後のEVT細胞選別およびフローサイトメトリーのゲーティング戦略。(A) decidua basalis EVTおよび絨毛膜 EVT を選別するための代表的なゲート戦略。R1はフォワードサイド散乱図におけるライブセルゲートです。R2はCD45+白血球の排除ゲートです。R3はHLA-G+EGFR+EVTゲートです。R4は7-AAD-カスパーゼ3/7-ライブEVTです。R4ゲートは必ずしもソートに必須ではありませんが、ここでは一次エスベリットの実現可能性を示すために示します。(B) 96時間のin vitro培養後のHLA-G+EGFR+EVTの代表的なフローサイトメトリープロット。(C,D)カスパーゼ3/7-7-AADの頻度は、選別中(0日目)および培養96時間(4日目)に生体EVTで現れます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
図2。in vitro 培養中のEVTの形態学。 (A)24時間、(B)48時間、(C)72時間の培養後の絨毛膜性EVTおよび(D)24時間、(E)48時間、(F)72時間後の脊髄膜低下部EVTの代表的な光学顕微鏡画像。スケールバー=50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
図3。一次EVTの免疫表現型。 (A) 細胞外フローサイトメトリー染色(0日目)で決定された一次EVTにおけるHLAおよび共抑制分子の代表的なフロープロット。(B) ペア線プロットでは、0日目にd. basalisのEVT(青)および絨毛膜のEVT(緑)の各マーカーの完全な染色がIgG制御の生MFIを示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
図4。活性化リンパ球の有無にかかわらず、一次EVTの免疫表現型(4日目)。(A) 活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらず、72時間培養後のEVTの代表的なフロープロット(4日目)。(B) ペアリングプロットでは、活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらずEVTのMFIが示されます。青いプロットは基底楔骨EVT、緑のプロットは絨毛膜のEVTを表します。(C) カスパーゼ3/7-7-AAD-生EVTの代表的なフローサイトメトリープロット(活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらず)。(D) ペア線プロットは、活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらず、カスパーゼ3/7-7-AAD-ライブエベトの周波数を示します。青いプロットは基底楔骨EVT、緑のプロットは絨毛膜のEVTを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
表1。組織の解剖と消化のための重要な試薬。1、2、24も参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%201_final.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。</a>
表2。EVT培養およびT細胞との共培養のための主要試薬。1、2、24も参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%202_v2_final.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。</a>
表3。選別およびフローサイトメトリー解析のための主要な抗体および試薬。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%203_final.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。</a>

表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G+ 外芽外栄養芽細胞の精製

The human maternal-fetal interface represents a unique immunological environment where maternal immune cells and fetal extravilllous trophoblasts (EVT) ...

purification-hla-g-extravillous-trophoblasts-from-human-term

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、開発中の主要な造血器官として胎盤を同定した。我々はその造血幹細胞（HSC）が生成され、ユニークな微環境のニッチの胎盤で展開されている両方とも発見。ここで、我々はマウス胎盤における造血幹細胞の分離と可視化に必要な実験手法を説明します。...

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

このプロトコルでは、パーコール勾配を用いた栄養膜細胞の分離に続いて妊娠d10.5、上のマウスから胎盤の解剖について説明します。次に、マトリゲル浸潤アッセイで単離された細胞の使用例を示します。...

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

我々は、正の選択を用いた生きたヒト胚性幹細胞(hESC)の同定および濃縮のための蛍光活性化細胞分類(FACS)を介した細胞表面抗原の複合検出のためのモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2の使用と、混合細胞集団からのhESCCをパージするための否定的選択の使用について述べた。...

モノクローナル抗体TG30およびGCTM-2を用いた細胞表面抗原の検出によるヒト胚性幹細胞の濃縮とパージ

ここに記述されているのは、decidua basalisおよびdecidua...

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。...

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

この原稿は、低酸素/再酸素化下で培養された免疫精製されたヒト絨毛性細胞栄養細胞のユニークなin...

メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

ここでは、骨の形態形成タンパク質4とアクチビン/ノード経路の阻害剤を使用して、ヒト多能性幹細胞からヒト絨毛細胞を効率的に生成するプロトコールを提示します。この方法は、ヒト多能性幹細胞の効率的な分化に適しており、遺伝子操作のための細胞を大量に生成することができます。...

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

本研究は、リバーシブルの組織免疫染色、3 D レンダリングやひと胎盤絨毛サンプル 1-2...

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

このプロトコルは、アプリケーション (すなわち免疫細胞化学、フローサイトメトリー、等) の様々...

用語胎盤の胎児膜から主のひと脱落膜細胞の分離

ここでは、ガラス化されたヒト胚盤胞を温め、インビトロでの移植期間を通じてそれらを培養し、それらを単一細胞に消化し、さらなる調査のために早期の栄養芽細胞を採取する方法を説明する。...

ヒト胚形成期における栄養芽細胞の単一細胞回収

このプロトコルは、ウイルス感染の研究のために空気-液体界面で培養したヒト胎盤組織エクスプラントの調製について説明しています。...

エクスビブ 母体と胎児の界面を通じたウイルス伝播の研究のためのヒト胎盤外植培養

学ぶヒト胎盤組織からのHLA-G⁺外芽外栄養芽細胞の精製法。FACSによる高純度分離と流式細胞計測による表現型解析により、妊娠合併症の免疫学的メカニズムを解明する。

表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G⁺ 外芽外栄養芽細胞の精製

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