ナイメーヘン止血アッセイ:単一のウェルにおけるトロンビンとプラズミン生成の同時蛍光生成測定

私の研究は、二次止血と線維溶解を同時に測定し、全体的な止血バランスを測定することに焦点を当てています。現在のほとんどのアッセイは凝固や線維溶症の単離成分を評価しています。このアッセイは、1つのアッセイで両方のプロセスを同時に測定します。

まず、蛍光プレートリーダーを起動し、37度の温度に平衡させます。ソフトウェアでフィルター設定を設定し、波長ペアの数を2に設定してください。励起波長をトロンビン用に355ナノメートル、プラズミン用に485ナノメートルに設定します。

次に、発光波長をトロンビンで460ナノメートル、プラズミンが525ナノメートルに設定します。次に、プレートタイプを96ウェルのGreiner Flat Bottom Black Microplateに設定します。リードエリアに移動し、最大20ウェルを使いプレートレイアウトを定義してください。

PMTと光学設定は、PMTゲインを200ボルトに、1リードあたりのフラッシュ数を6回に設定してください。次にタイミングに移動して、合計1時間9分30秒、30秒のインターバルでタイミング設定を確認しましょう。最初の読み上げの3秒前にシェイクを確認するために「シェイク」に移動してください。

「さらなる設定」に移動して、読読順が「列」に設定されているか確認してください。「読み取る前の化合物転送」設定を設定し、化合物転送数を1に、初期体積を120マイクロリットルに設定してください。ピペットの高さが130マイクロリットル、体積が20マイクロリットル、速度が1マイクロリットル毎秒、時刻が14秒であることを確認してください。

「Compound Source」で96井戸Compound Plateフォーマットを確認し、特にBeckman 96 2.3ミリリットルのオプションを選択してください。ピペットチップのレイアウト設定を正しいカラムを選択して確認してください。次に「複合ヒントの列」に移動し、正しい列を選択します。

マイクロプレートシェーカーの温度を37度に設定し、使用前に温度を確認してください。次に揺れ強度を1,100回転/分に設定します。次に、患者の血漿と通常のプール血漿を37度の水浴で最大10分間溶かします。

血漿サンプルを十分に混合し、完全な解凍が確認され、目に見える氷降水が見られません。ピペットを使い、患者血漿または通常のプール血漿を80マイクロリットルの患者血漿を、選定されたウェルに新しいピペットチップを各サンプルごとに追加します。次に、48マイクロリットルのセファリンと48マイクロリットルの組織因子を混ぜて基質混合物を準備します。

これに240マイクロリットルの塩化ナトリウムバッファーを加え、さらに96マイクロリットルのトロンビン基質と48マイクロリットルのプラズミン基質をピペットで充填します。各ウェルに基質混合物を20マイクロリットルピペットで抽出します。その後、握手しましょう。

次にマイクロプレートを蛍光プレートリーダーに挿入し、数分間37度で平衡させます。三塩化ナトリウムバッファー、トリソリウム塩化カルシウムバッファー、組織プラスミノゲン活性化剤を組み合わせて開始試薬を準備します。ボルテックスを徹底的に混ぜてみる。

化合物カラムのすべての行に開始試薬混合物をピペットで移管します。開始試薬混合物を含む板をソースドロワーに挿入し、蛍光測定を開始します。蛍光信号を30秒ごとに70分間記録してください。

測定中はプレートを37度の温度に保ち続けてください。データ解析では、動態蛍光データを時刻点と各井戸の蛍光値を含む表としてエクスポートします。一次微分を計算し、各ウェルの酵素生成曲線をプロットして、時間経過によるトロンビンやプラスミン生成を可視化します。

止血アッセイにより、トロンビンとプラズミン生成の同時時間分解測定が可能となり、凝固と線維溶症の統合評価が可能となりました。トロンビン生成曲線からは、遅延時間、ピーク高さ、トロンビン電位など複数のパラメータが導出されます。遅延時間の延長、ピークの低さ、トロンビン電位の低下は、トロンビン生成の障害を示しています。

また、プラスミン生成曲線はフィブリン溶解時間やプラズミンピーク高さなど複数のパラメータを提供します。フィブリン溶解時間の短縮と高いピーク高さは、血漿生成の増加を反映しています。3つの健康な対照群および正常なプール血漿のトロンビンおよび血漿生成曲線は、正常な止血機能の基準プロファイルとして再現可能なピーク高さ終了タイミングを示しました。

因子V活性が3%の患者では、トロンビン生成が全くなかった。しかし、プラズマ生成はわずかに増加しました。因子V活性が44%の患者は、血栓生成が正常範囲内にとどまる中、血栓生成が正常範囲内にとどまる中、血栓生成が遅延時間が長くなり、ピーク高さが減少した。

アルファ2抗プラズミン欠損症では、アルファ2抗プラズミン活性の低下に対抗して血漿生成が増加しました。活性23%のホモ接合患者は、プラズミン生成の早期開始、フィブリン溶解時間の短縮、血漿ピークの上昇を示しました。これらの変異は、活性73%のヘテロ接合体患者でも観察されましたが、それほど顕著ではありませんでした。

止血アッセイは、まれな凝固因子欠損症、線維溶離障害、止血薬効果の研究に適しています。主な課題は、技術の標準化と、部屋や実験室間での比較可能性を高めるための結果の正規化です。今後の研究では、アッセイの自動化や全血漿やプレート豊富な血漿との適合性を追求するための適応開発に重点が置かれる可能性があります。