ラット橈骨骨折の新規内固定モデルの開発:骨折治癒評価と背根神経節の分離

橈骨骨折は世界的に非常に一般的であり、四肢長骨骨折の主な原因の一つです。ラットの橈骨骨折モデルは、骨折治癒、薬物スクリーニング、整形外科研究における生体材料評価の研究に不可欠です。ラットの半径が比較的細いため、現在臨床で使われている鋼板やネジはラットの橈骨骨折の治療には適していません。

この制約を克服するため、プロトコルは縫合とチタン針固定を革新的に組み合わせ、内固定研究のための安定した橈骨骨折モデルを確立しています。プロトコルでは、ラットの骨折治癒を明らかにするために生きた動物マイクロCTイメージングシステムの利用も紹介しました。また、ラット骨折モデルにおけるDRGの抽出と培養を示し、神経損傷および骨折修復のメカニズムを研究するために用いられる。

ラット骨折手術器具には、メス刃、メスの柄、手術用ハサミ、針ホルダー、止血鉗子、歯状組織鉗子が含まれます。オスのスプラグドーリーネズミ、生後約8週間、体重約200グラム。イソフルランガス麻酔装置でラットを麻酔し、手術中は人工呼吸麻酔を維持します。

手術室の温度を28°Cに保ちます。ラットを横向きの位置に置きます。右前肢を露出させ、ヘアクリッパーで毛を剃ります。無菌シートを布の厚くし、右前肢の近位部に止血帯を巻いて手術出血を抑えてください。

アルコールとベタジンのスクラブを交互に3回入れて皮膚を準備します。右前腕の背側橈骨側に縦に1.5cmの切開を入れます。筋肉の隙間を分けて、右前肢の半径を完全に露出させます。

手術用のハサミを使って半径を切り、横断骨折を作ります。ハサミの方向は半径に対して90度の角度を形成します。直径0.8mm、長さ10mmのチタン針を取り、縦軸に沿って放射状の断裂に挿入します。

橈骨とチタン針を縫合で固定してください。縫合糸は3回連続で結ばれ、チタン針は4本の中断縫合で橈骨に固定されました。余分な縫合線の皮膚色を縫合し、木材を閉じます。

ベタジンのスクラブで皮膚を消毒してください。傷口を滅菌ガーゼで覆い、包帯で固定してください。麻酔後に意識を取り戻し、容体も順調に回復しました。

イソフルランガス麻酔装置でラットを麻酔します。スキャンチャンバー内でネズミを伏せに置く。標的スキャン領域を視野の中心に調整し、手術中は人工呼吸と麻酔を継続的に維持してください。

固定された動物ベッドをスキャンチャンバーに押し込み、チャンバーの扉を閉めます。マイクロCTスキャンパラメータは以下の通りに設定されました:スキャンモード:標準、露光時間:2分、視野角:72mm、ボクセルサイズ:144m、キロボルト:90;マイクロアンペア:88、フィルター:3Dソフト。スキャンデータは自動的にソフトウェアに送信され、三次元CT画像が生成されます。

標的組織を分離してください。処理済み画像をエクスポートします。脊椎を切断し、C1からC7までの椎体を切除します。

頸椎を前後の正中線に沿って切断し、左右の半分に分けます。歯型組織の鉗子でDRGを持ち上げ、優しく持ち上げてから、手術用のハサミで神経線維を切断します。抽出したDRGを1.5 mLの遠心分離機チューブに移し、抽出媒体を使います。

氷の上に置いておきます。ゆっくりと吸引して抽出液を捨てます。混合消化液と酵素作動液を1mL加えます。

37°Cの水浴で60〜70分消化します。適切な量のフィブロネクチン作動液をペトリ皿にピペットし、37°Cのインキュベーターで1時間コーティングします。消化後、混合消化酵素作用液を吸引して捨てます。

ろ過液を集め、70 x gで遠心分離機で8.5分間かけます。遠心分離後、上清液を吸引して遠心分離機のチューブ内で排出します。沈殿物を再懸浮させるために1mLの全培地を加えます。

ペトリ皿を取り出して。フィブロネクチンの作動液は捨ててPBSで2回洗いましょう。細胞をペトリ皿に接種し、1mLの完全な培地を加えます。

一定温度の37°C、5%二酸化炭素のインキュベーターに8〜12時間入れます。マイクロCT画像により、橈骨骨折ラットモデルおよびラット骨根骨折の内固定モデルの確立が成功したことが確認されました。モデリングから20日後、骨折モデル群のSDラットのマイクロCT解析で良好な予後が示されました。

骨折端の架橋に硬骨が形成され、骨折線は進行的に融合し、徐々に消失していくことが骨結合の初期段階と一致します。画像には、モデル化された領域にぼやけた骨折線が見られ、骨折部位の骨組織がほぼ治癒していることが示唆されました。DRG分離後5日目から6日目にかけて、神経細胞は広範な細胞質曝露を示します。

この段階では、神経細胞体全体とその周囲のシナプスが明確に区別できます。培養6日目に免疫蛍光顕微鏡を用いて神経細胞の写真撮影を行いました。図9に示すように、ベータIIIチューブリンは緑色蛍光として示されました。

DRG細胞体と軸索を含むベータIIIチューブリン陽性細胞は緑色に染色され、青色蛍光はDAPI染色されたニューロンの核を表しています。ラットは、明確な遺伝的背景と短い生殖周期から、骨折治癒のメカニズムを研究する古典的なモデルです。しかし、直径が約1〜1.5mmと小さいため、臨床グレードの内固定装置と一致することは不可能であり、神経骨治癒研究における有用性を大きく制限しています。

この問題に対応するため、本研究は革新的に複合縫合チタン針の内部固定法を提案しました。基本的な考え方は、スクリューの硬い固定を縫合糸の柔軟な結紮に置き換え、医因性神経損傷を減らし、安定した機械的環境を提供することです。このプロトコルはモデル構築の再現性と標準化を提供しました。

縫合糸とチタン針は、ラットの橈骨骨折モデルにおける内固定に使用されます。骨折の治癒はマイクロCTで評価されます。一次DRGニューロンは骨折治癒検査後に単離・培養されます。

プロトコルでは、ラットの橈骨骨折モデルにおいて、縫合糸とチタン針を革新的に組み合わせて安定した内固定を実現しています。骨折治癒はマイクロCTで評価され、一次DRGニューロンは単離されて培養され、さらなる調査が行われました。