CAR T細胞におけるCRISPR-Cas9スクリーニングの改良:ライブラリー調製のための洗練された方法

私たちの研究は、CRISPRスクリーニング手法を用いて標的を特定し、CAR T細胞療法の有効性を高めることに焦点を当てています。現在の実験課題には、CRISPRスクリーニング手法における再現可能な実験室手法の達成が含まれます。まず、T細胞を含む24ウェルプレートにあらかじめ決められた量のレンタウイルスCRISPRライブラリを追加します。

最終濃度8マイクログラム/ミリリットルのポリブレインを加えます。均一に混ぜるように混ぜてください。細胞を700Gで32度Cで90分間遠心分離し、スピンフェクションを行います。

遠心分離後、慎重にプレートを遠心分離機から取り出します。培地を新しいT細胞培養菌に置き換えてください。6時間後に感染倍数3のCARレンタウイルスベクターを追加します。

細胞は37度の環境で4日間培養します。培養が完了したら、CAR T細胞を採取します。PBSで一度洗ってください。

次に、アクラジンオレンジのヨウ化物プロピジウムで染色し、蛍光細胞カウンターで数えます。4マイクロモルのcas9溶液を電気穿孔バッファーで準備します。5×10乗の6つのCAR T細胞を50マイクロリットルのCas9溶液に再懸濁します。

次に、泡を発生させないまま、複数ウェルのキュヴェットストリップの各ウェルに50マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットで注入します。ピペットの先端をウェルの縁に沿って優しく滑らせて、見える気泡を除去します。拡張T細胞3プログラムを使ってCAR T細胞の核攻撃を行います。

キュベットを37度のインキュベーターで40分間入れます。核分離された細胞をT細胞増殖培地に再懸浮させます。その後、37度の温度で3日間再度培養します。

蛍光セルカウンターでアクラジンオレンジのヨウ化プロピジウム染色を用いて細胞数を数えます。細胞密度を1ミリリットルあたり6細胞のべき乗の10に調整した後、最終濃度2.5マイクログラム/ミリリットルにプリマイシンを加えます。6日間の潜伏後、フローサイトメトリーを用いてCAR陽性細胞の割合を評価します。

次にCAR T細胞集団を選別し、乾燥細胞ペレットをマイナス80度の温度で保存します。細胞および組織DNA抽出法を用いてサンプルからゲノムDNAを抽出します。二本鎖DNA定量キットを用いてゲノムDNA濃度を測定します。

次に、最大5マイクログラムのゲノムDNAを、選択された制限酵素20単位を合計50マイクロリットルで消化します。サーモサイクラーで37度の温度で一晩培養します。翌日、10ミリリットルのミリモラトリスHCLと50ミリリットルの新鮮な70%エタノールを含む10ミリリットルの洗脱バッファーを準備します。

消化された生成物100マイクロリットルを、渦巻きビーズ入りのチューブにピペットで移します。ピペットで懸濁液を十分に混ぜ、室温で5分間培養した後、さらに5分間磁化します。磁石上で上清液を捨て、ペレットを乱さずに200マイクロリットルの70%エタノール溶液をピペットに入れます。

30秒後に上清液を捨て、さらに2回アルコール洗浄を行います。2回洗った後、ビーズを2分間乾かし、その後磁石から外します。エルシアンバッファーとピペットを40マイクロリット加えてビーズを再懸浮させます。

懸濁液を2分間磁化し、その後上清液を新しいチューブに移します。ボルテックスストレプタビジン磁気ビーズ1ミリグラム入ったチューブに×ウォッシュ結合バッファー1個を加えます。ピペットでバッファー内のビーズを再懸浮させます。

その後、懸濁液を磁石に1分間置き、上清液を捨ててさらに2回洗浄します。3回目の洗浄後、ビーズを2×のウォッシュバインディングバッファーに再投入します。次に、精製された消化産物に10マイクロモルのビオチニル化プルダウンプライマーを5マイクロリットル加えます。

混合物を96度の乾燥水槽で5分間孵化し、すぐに氷で5分間冷ます。反応に洗浄されたストレプトビジン磁気ビーズを1ミリグラム加え、反応とストレプタビジンビーズの体積が均等になるようにします。室温で20分間培養し、4分ごとに再懸浮させます。

ビーズを5分間磁化し、その後1×ウォッシュ結合バッファーで3回洗います。最後に、結合したsgRNAカセットを含むビーズを50マイクロリットルのエルシアンバッファーに再懸浮させます。sgRNAライブラリを準備・増幅し、シーケンスします。

抗生物質選択後、CRISPRライブラリを用いたCAR T細胞は、プロマイシン治療後も両ドナーで生存と増殖が継続しました。CRISPRライブラリのトランスダクションを欠く未導入のT細胞およびCAR T細胞は、抗生物質選択下で同様の増殖を示さず、陰性対照群として機能しました。NDELおよびPSPXIによる制限酵素消化は、単一ガイドRNAカセットを保持しつつ、断片化されたゲノムDNAを生成しました。

その後、sgRNAを含む断片を選択的に増幅しました。PearsonおよびSpearmanの相関により、単一ガイドRNAリード数とライブラリーの複雑さは、プラスミドライブラリと比較してドナーゲノムDNAサンプルで維持されていました。堅牢なランク集約解析により、Cas9編集後に両ドナーで有意に濃縮または枯渇した遺伝子が特定されました。

経路富集解析により、特定された遺伝子調節因子に関連する主要な遺伝子オントロジー用語が明らかになりました。当プロトコルは、CRISPRスクリーニング手法を用いた既存の実験技術に代わる信頼性の高い代替手段を提供します。本研究の成果は、より再現性が高く堅牢なCRISPRスクリーニングプロトコルの開発を支援することで、この分野の発展を推進するでしょう。

私たちの結果は遺伝子の同定の道を開き、CAR T細胞の表現型と機能を高めるために調節可能となりました。