生体内での老化マーカーの空間評価のための多重免疫蛍光アッセイ

老化細胞の空間解析は、老化、がん、免疫、正常組織の恒常性などのプロセスへの寄与を理解する上で重要です。老化細胞の検出は複数のバイオマーカーのプロファイリングに依存しています。多重免疫蛍光イメージングにより、これらの画像を単一の組織切片内で高スループットでプロファイリングすることが可能です。

まず、最大サイズが4×2センチメートル四方の厚さ5マイクロメートルのホルマリン固定パラフィン埋め込み組織断片が、正に帯電した顕微鏡スライドの中央に取り付けられ、カバースリップレススライドホルダーの観察窓内で明確に見えることを確認してください。試料の準備工程は、クローキング解除チャンバーを使った手動または自動染色装置で行うことができます。用意したスライドをカバースリップレススライドホルダーに入れます。

上端と右端を金属製のストップに合わせます。両手で同時にスライドをロックして、プラスチック製カムを閉じた南京錠の位置に回します。スライドが完全に平らに収まっていて、ホルダー内で揺れていないか確認してください。

ClickWellを置き、チャンバーをスライドの上に挿入し、両手でサイドバーをつまんで圧力を抑え、破損を防ぎます。リン酸塩緩衝食塩水に50%グリセロールを含むマウンティングメディア2ミリリットルをクリックウェルに充填します。スライドの左側にどちらの向きでもバーコードラベルを追加し、画像撮影を進めます。

領域選択および自己蛍光解析のために、Mx ワークフローバージョン4204、多重イメージング取得ソフトウェアを起動してください。ツールをクリックしてプロトコル出版社を選択してください。マルチプレックスプロトコルパブリッシャーのポップアップでプロトコル名を入力します。

「Create Setup Round」をクリックし、その後「Add Next Protocol Round」を選んで、複数のバイオマーカー表示ラウンドを作成できます。「公開」をクリックし、ポップアップウィンドウで「OK」を選択してください。仮想H&E画像のためにCy3チャンネルを取得してください。

スライドをクリックしてから「新しいバッチを作成」です。プロトコル名を選択した後、スライドIDを入力してください。「Add Slide」をクリックし、マルチプレックス実験ワークフローを作成するために「Create Batch」を選択してください。Cell DIVE取得ソフトウェアを起動します。

スライドを顕微鏡に読み込むには「ロード」をクリックしてください。ツールのドロップダウンメニューで、グリッドアイコンをクリックして希望する領域を定義し、移動ツールを使って定義した領域を再配置します。次に、描画ツールを使って不要なフィールドを選択し外し、各視野に少なくとも2つの隣接する視野があることを確認してください。これにより縫い付けの問題が軽減され、「リージョン」をクリックします。

MxワークフローウィンドウでViewer QCをクリックするとCell DIVEビューアーのページを開き、組織画像を10倍倍で可視化します。画像補正アイコンをクリックすると明るさを調整し、ポップアップウィンドウで「Pass and Reload Slide」を選択するために「QCを送信」をクリックしてください。画像が再読み込まれたら、「ROIを追加」をクリックして描画し、興味のある領域を調整してください。

希望する視野を選択し、ROIを繰り返し加算します。次に「ラボに送信」をクリックして、スライドを読み込み20倍の自己蛍光画像取得を開始します。

画像QCメニューで、特定のスライドIDに対応するチェックボックスを選択し、「ビューアーQC」をクリックします。読み込まれた画像をズームインして、ピントが合わない部分やアーティファクトがないか探します。各チャンネルの背景画像を確認し、最終バイオマーカー信号から引き算を差し引いてください。「QCを送信」をクリックし、「パス」と「終了」を選択して背景画像を生成します。

連続バイオマーカー染色の前に、抗体を室温で13,000 Gで1分間遠心分離し、アーティファクトを抑えます。抗体溶液を、0.3%の牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で200分の1希釈して準備します。ClickWellポートからピペットで取り出してマウントメディアを取り外します。

そして、0.01%のTween 20またはPBSTを含むPBS2ミリリットルで5分間3回洗います。染色チャンバー内でサンプルを完全にカバーするために、ポートに350マイクロリットルの抗体溶液を加えます。室温で1時間培養します。

次に、ClickWellポートから抗体溶液をピペットで抽出します。そして、PBST2ミリリットルで3回5分間洗います。マウンティングメディアを2ミリリットル加えます。

ClickWellホルダーを顕微鏡に挿入し、スライドを装填して20倍バイオマーカーの画像撮影を開始します。ブレンドエディターと画像補正オプションを使って画像QCを行い、画像QC評価を提出してください。ClickWellポートからマウントメディアをピペットで取り出し、PBST2ミリリットルで5分間3回洗浄します。

使用前に染料不活化液を新たに準備してください。PBSTを除去した後、各スライドごとに2ミリリットルの染料不活性化液を加えます。スライドホルダーで15分間孵化します。

ClickWellポートから染料不活性化液をピペットで取り出し、PBST2ミリリットルで5分間洗います。2ミリリットルのマウンティングメディアを加え、ClickWellホルダーを顕微鏡に挿入すると、自動のラウンド特異的20倍自己蛍光画像を開始します。完了時に画面上の指示通りにQCステップを進めてワークフローを進めます。

必要に応じて連続染色、染料不活性化、多重イメージングを繰り返し、完了するまで続けます。HALOソフトウェアを使って、組織コアの異なる領域におけるマーカーの局在を可視化するために様々なチャネルを選択します。「分析」をクリックし、「画像全体」を選択して、個々のマーカーの定量的指標を分析します。

結果をクリックすると、解析された組織コア内の細胞数と特定のマーカーを発現する細胞のサブセットが表示されます。自動スライド染色法と比較して、手動のデクロークチャンバー方式は組織剥離や細胞の喪失やスリップを特徴とする組織アーティファクトの発生頻度が高まりました。代表的な膵臓組織に対してデジタル病理ソフトウェアを用いた定量化では、p16陽性細胞はLB1値の低下と関連し、その逆も同様であり、老化に関連するマーカーパターンと一致するプロファイルを示しました。

Zスコア正規化ヒートマップは、p16陽性ラミンB1陰性老化表現型の分布を示し、肺、副腎、下垂体に高濃度の老化細胞が存在し、p16の上昇とLB1レベルの低下に対応していることを示している。逆に、虫垂、リンパ節、脾臓は低老化を示し、LB1が高いと低いp16発現を維持しました。このプロトコルにより、単一の顕微鏡スライド内で老化、構造的バイオマーカー、免疫バイオマーカーの組み合わせを探査することが可能です。

複数のマーカーを単一サンプル内に組み合わせることで、組織構造や老化細胞分布の空間解析が可能です。今後の応用には、複数の組織タイプにわたる老化バイオマーカーの大規模プロファイリングや、空間オミクスとの統合による細胞異質性の解明が含まれます。