FACSを用いたマウス皮質組織からのペリサイト分離

私たちの研究は、脳寄生虫の血管役割と神経血管ユニット内での相互作用に焦点を当て、脳機能の理解を図っています。低画像診断および腸内空間FACS、脳血管内の寄生虫機能のマッピング、特定の役割および治療標的を明らかにすること。まず、安楽死したマウスの頭部と首部に75%エタノールを散布します。

メスを使って、後頭から前頭部にかけて頭皮の正中線切開を行い、頭蓋骨を露出させます。両側眼窩の前方に横切開を行い、その後小脳の下縁に沿って横切開を行い、頭蓋骨の基部を剥離します。矢状縫合線に沿って後方から前方へ縦方向にカルバリウムを切開します。

頭蓋板を持ち上げてデュラメーターを使い、脳を露出させます。外科用ハサミを使い、視神経と延髄の脊髄接続を切断しながら脳を優しく持ち上げます。無傷の脳を10センチメートルの皿に、10ミリリットルの氷のように冷たいPBSを入れて優しく入れ、損傷を防ぎます。

脳をアルミホイルに移す。くも膜下腔を露出させてください。鉗子で硬膜を除去した後、ハンクのバランスソルト溶液で洗い流します。

ティッシュをフィルターペーパーに移し、丸めてピントを取り除く。カミソリの刃で嗅球と尾部の部分を切り取り、脳を冠状に2〜3ミリメートルの厚さのスライスに分けます。脳梁に沿って大脳皮質を隔離してください。

皮質組織を3ミリリットルの氷冷組織採取バッファーを含むアンプルに移します。外科用メスを使い、組織とアンプルを約1×1ミリメートルの断片に細かく刻み、組織の鮮度を保つために5分以内にミンチングを完了させます。組織採取バッファー付きのプレリンスピペットチップ。

次に、ピペットを垂直に持ったまま、細かい断片をゆっくりと先端に吸引します。破片を予備冷却された15ミリリットルの遠心分離機管に優しく排出します。元のアンプルはPBS生理食塩水に2%FBSで洗い流します。

洗浄液を同じ遠心分離機のチューブに移し、300Gで4度の温度で5分間遠心分離機に入れます。遠心分離後、上清液は捨てます。各ペレットをCD酵素作用液3ミリリットルに再懸浮させます。

懸濁液を均等に3本のチューブに分け、さらに酵素溶液を加えて最終的に1本あたり5ミリリットルの体積にします。チューブを37度のオーブンで100分間孵化し、100Gの軌道振動で加熱します。培養中、PBS中の2%FBS10ミリリットルに1ミリリットルのDNASE-1溶液を加えます。

消化を終えるために、300Gで4度Cで5分間遠心分離します。その後、各ペレットを1ミリリットルの組織解離液に再懸浮させます。溶液を100回ピペットで除去して機械的解離を助けます。

次に、すべての懸濁液を1本の50ミリリットル遠心分離機管にまとめます。各チューブを2ミリリットルのバッファーですすいで洗浄液を混同します。300Gで4度Cで5分間遠心分離し、最上層を廃棄した後、20%BSAを12.5ミリリットル加えて逆さまに混めます。

遠心分離機で1000G、4度Cで20分間。次に底のペレットを集め、上清液を新しい50ミリリットルの遠心分離機チューブに移します。再び遠心分離する前に、優しく再懸浮します。

各ペレットをPBSで2ミリリットルの2%FBSに再懸濁してください。その後、両方のサスペンションを1本のチューブにまとめます。300G、4度Cで5分間、複合サスペンションを遠心分離します。

上澄液を捨てた後、最後のペレットを2%FBSを含むPBS2ミリリットルに再懸浮させます。15ミリリットルの遠心分離機チューブを4本、1回あたり22%の溶液4ミリリットルを準備します。細胞懸濁液を0.5ミリリットルのアリコットを各勾配に優しく重ね、遠心分離機で560G、4度Cで10分間浸します。

上清液を吸引した後、各ペレットをHBSS BSAグルコースバッファー1ミリリットルに再懸浮させます。そしてサスペンションを新しい15ミリリットルのチューブに引き込んでください。パーコルチューブを2ミリリットルのバッファーですすいで洗浄し、300Gで遠心分離、4度Cで5分間分離する前に、洗浄液を混じます。

フローサイトメトリーでは、スーパーナダタントを吸引した後、ペレットをHBSS BSAグルコースバッファー1ミリリットルに再懸浮させます。FC受容体遮断試薬を5マイクロリットル追加し、4度で5分間培養します。その後、懸濁液に対して蛍光結合抗体をピペットで抽出し、インキュベーションします。

細胞をHBSS BSAグルコースバッファー6ミリリットルで洗浄します。その後、サスペンションを300G、4度Cで5分間遠心分離します。上清液を吸引した後、ペレットを1ミリリットルのバッファーに再懸浮させます。

7アミノアクチノマイシンD溶液を200マイクロリットル追加し、氷で10分間培養します。その後、最終量をHBSSバッファーにBSAとグルコースを補足して2ミリリットルに調整します。選別回収チューブの内側表面を1%BSA溶液で洗い流します。

余分な溶液を吸引し、各チューブにちょうど1ミリリットルの溶液を残します。卵管は氷の上に保管して、選別された細胞を受け取ってください。脳組織から解離した細胞は、フローサイトメトリーの選別中に細胞残骸を排除するために、前方散乱領域と側散乱領域によって順次ゲートされました。

造血細胞および血小板汚染物質を除去するために、CD45陽性およびCD41陽性の二重陽性イベントを除外しました。CD13陽性の血管壁細胞が濃縮されました。また、7つのアミノアクチノマイシンD陰性ゲーティングを用いてアポトーシス細胞を除外し、その後CD31陰性選択を用いて寄生虫を分離しました。

フローサイトメトリーの選別では、核細胞が全イベントの59.8%を占めていることが示されました。CD13陽性細胞は全イベントの1%を占めました。そして、最終的なCD13陽性CD31陰性寄生虫集団は全イベントの0.7%を占めました。

選別細胞のUMAP次元削減により、分離集団内で細胞異質性を示す6つの明確な主要クラスターが明らかになりました。Zスコア正規化ヒートマップ解析により、寄生虫マーカー遺伝子は0から3のクラスターで高度かつ主に発現していることが示されました。クラスター比率分析では、クラスター0から3までのクラスターが総人口の87.1%を占めていることが示されました。

平滑筋細胞マーカーはクラスター4で10.14%、線維芽細胞マーカーはクラスター5で2.77%で濃縮されていましたが、このプロトコルにより研究者は単一細胞シーケンスおよび機能解析に適した高純度のウェアラブル寄生虫を単離できます。主な課題は、高度に特異的な寄生虫マーカーの欠如、複雑な隔離、そして長期的な汚染のリスク増加です。今後の研究では、寄生虫特異的マーカーの特定に焦点を当て、分離の改善、より深い機能特性評価、標的治療的研究が可能になります。