組織工学応用のためのヒト皮膚細胞内のトンネルナノチューブ検出の標準化方法

私たちは、人間の皮膚細胞間のトンネルナノチューブを確実に検出・解析し、その皮膚再生における役割を研究する方法を開発しました。当プロトコルは固定サンプルまたは一次ヒト皮膚細胞向けに設計されています。皮膚生物学や組織再生に関する研究に役立ちます。

まず、適切な培地を含む60ミリの皿でヒト表皮ケラチノサイトと皮膚線維芽細胞を解凍・培養します。蘇生時にケラチノサイト培養にY-27632を最終濃度5マイクロモルまで補足します。すべての培養物は加湿インキュベーターで37度Cに保ち、約80%の合流率に達するまで保ちます。

その後、培地を培養皿から取り出します。洗浄時に生理的なpHと浸透圧を維持するために、細胞を1ミリリットルのPBSで短時間洗い流します。PBSを完全に吸引してください。

0.05%トリプシンEDTAを1ミリリットル加え、細胞表面に均等に分散させます。皿を37度で1.5〜2.5分孵化させます。ピペットで上下にピペットして細胞を優しく再懸浮させます。

トリプシンを中和するために2ミリリットルの培地を加えます。細胞懸存液を15ミリリットルのチューブに移し、室温で200Gで遠心分離機で5分間処理します。遠心分離後、遠心分離機チューブから上清液を捨てます。

細胞ペレットを1〜2ミリリットルの培地に再懸浮させ、自動カウンターで細胞数を数えます。次に、8ウェルのチャンバースライドの各ウェルに12,000個の皮膚線維芽細胞または20,000個のケラチノサイトを、最終体積400マイクロリットルの最終体積でまきます。シード後は、細胞を均等に分散させるためにチャンバーをよく交差振らせ、約24時間37度で培養します。

培養後、顕微鏡で細胞の合流率が約80%かどうかを確認します。培養液が80%のコンルテンシーに達したら、細胞をプレフィフィックスするために数滴の固定液をチャンバーウェルに直接優しく加えます。細胞を室温で4分間培養し、固定液が均等に広がり細胞を乱さないようにします。

次に井戸からプレフィクティブを吸引し、140マイクロリットルの新しい固定剤溶液1を加えて、井戸表面を完全に覆います。スライドを37度の温度で15分間孵化させます。次に、固定剤をチャンバー井戸から取り出し、100ミリモラ塩化アンモニウム140マイクロリットルを加えて残留アルデヒドを焼き付けします。

スライドは室温で10〜30分孵化します。サンプルをPBSで3回、室温でそれぞれ30秒ずつ洗い流します。洗浄の際は、細胞を洗い流したりトンネルナノチューブを損傷させないように、緩衝材をチャンバー壁に沿って優しくピペットで動かしてください。

細胞をPBS中に1:300の小麦胚凝集素Alexa小麦粉共役液の140マイクロリットルで培養します。暗闇で室温下で20分間インキュベーションを行い、膜由来のトンネルナノチューブの可視化のために細胞膜糖タンパク質を標識します。その後、細胞をPBSで3回30秒ずつ洗浄します。

次に、1%BSAで1〜250倍希釈したファロイジン共役140マイクロリットルを室温の暗い場所で30分間培養します。細胞をPBSで3回洗浄した後、140マイクロリットルのDAPI溶液と共に室温の暗い環境で5分間培養します。最後に、各ウェルに2〜3滴のマウンティングメディウムを加え、常温で20分間培養します。

スライドは暗闇で少なくとも20分間、4度の温度で保存し、画像撮影を行ってください。皮膚線維芽細胞培養では、トンネルナノチューブが隣接する細胞を長く細い突起として観察し、膜は小麦胚凝集素とFアクチンで染色され、ファロイジンで標識されました。表皮ケラチノサイト培養では、特徴的なF-アクチン正の突起を持つトンネル型ナノチューブが隣接細胞をつなぐことも観察されました。

皮膚線維芽細胞と表皮ケラチノサイトの共培養では、膜およびサイトケラチン5染色によって、皮膚線維芽細胞と表皮ケラチノサイト間にトンネル状ナノチューブが一貫して検出されました。共培養中のトンネル型ナノチューブは、F-アクチンのみを含む例、フィラメント、部分的なα-チューブリンを含むF-アクチン、または低いα-チューブリンレベルの例として多様な細胞骨格の組織を示しました。最大の課題はナノチューブ内でトンネルを保存することです。

これには、穏やかな固定、適切なタイミング、そして新たに調製した固定添加剤の使用が必要です。当社のプロトコルを用いることで、トンネルナノチューブの特性を異なる細胞条件下で測定し、その潜在的な機能を探ることができます。将来的には、トンネルナノチューブによるミトコンドリアの転移を研究するために蛍光標識を行います。