LncRNAノックダウン骨肉腫細胞の増殖能力を検出するコロニー形成アッセイ

私の研究は骨肉腫に焦点を当てており、コロニー情報アッセイを用いてLncRNAノックダウンが長期的な増殖能力にどのように影響するかを調べることを目指しています。まず、5×10×10の143B骨肉腫細胞を2つの10センチ培養皿にシードします。細胞を完全なDMEMで培養し、37度の温度で10%胎児用牛血清を補足し、5%二酸化炭素インキュベーターで培養します。

24時間後にプラスミド、ポリエチレンミン、オプティミニウムエッセンシャル培地を含むトランスフェクション試薬を準備してください。各試薬を渦巻き、使用前に室温に平衡させます。次に、マーカーペンを使って1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管4本を標識し、プラスミドとポリエチレニミンを標識します。

各チューブに500マイクロリットルのOptiMinium Essential Mediaをピペットで移します。次に、対応するプラスミドチューブに10マイクログラムのプラスミドを加え、各ポリエチレンイミンチューブに30マイクロリットルのポリエチレンニミンをピペットで注入します。各チューブをピペットで上下に優しく混ぜて培養します。

次に、各プラスミドチューブと対応するポリエチレニミンチューブを結合します。優しく混ぜて室温で20分間孵化させます。143B細胞を含む皿から培養培地を優しく吸引します。

各皿に7ミリリットルの血清不使用培地を加え、プラスミドの種類に応じてラベルを付けます。準備済みのトランスフェクション混合物を、対応する培養皿に滴りずつ加えます。外側の端から皿の中央に向かって円を描くようにゆっくりと混合を加えます。

細胞は37度Cで5%二酸化炭素のインキュベーターで培養します。上澄液は8〜12時間後に廃棄します。次に、培養皿に完全なDMEMを10ミリリットル加えて培養します。

培地を交換してから72時間後に蛍光顕微鏡で細胞を観察し、培地を培養皿から取り出します。細胞を消化するためにトリプシン-EDTA酸を1.5ミリリットル加えます。細胞は優しくピペットで細胞を剥離します。

次に、消化を終わらせるために5ミリリットルの完全な培地を加えます。細胞懸濁液を15ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移します。その後、細胞懸濁液20マイクロリットルをヘモサイトメーターにピペットで移し、細胞数を数えます。

リボ核酸抽出のために3×10の5の乗を採取し、ノックダウン効率を検証します。次に、1ウェルあたり3セルの乗数の2×2を種まき、6ウェルプレートに植えます。ピペットでDMEMを最終体積2ミリリットルまで完成させます。

細胞を37度Cで5%二酸化炭素インキュベーターで培養します。コロニー形成を毎日監視してください。対照群のほとんどのコロニーが少なくとも50個の細胞を含み、または10〜14日間の潜伏後に培養を終了します。

上清液を捨てた後、1ウェルごとに1ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄し、洗浄後は溶液を捨てます。細胞を10%ホルマリン溶液1ミリリットルに15分間固定します。固定剤は捨て、細胞を1ミリリットルずつPBSで2回洗浄します。

細胞を0.5%の結晶バイオレット溶液1ミリリットルで10〜30分間染色します。その後、ゆっくり流れる水道水で皿を優しく洗います。セルは室温で自然乾燥させます。

カメラを使ってコロニーの写真を撮影しましょう。143B細胞のトランスフェクション効率は、トランスフェクション後72時間後に蛍光顕微鏡で確認され、両条件下で効率的なプラスミド送達が認められたことを示しました。RT-qPCR反応解析により、shSNHG6をトランスフェクトした143B細胞で、shNC群と比較してSNHG6発現が有意に減少していることが示されました。

コロニー形成アッセイでは、SNHG6ノックダウン群のコロニー数と規模が対照群と比べて有意に減少していることが示されました。このプロトコルは単細胞の長期増殖を評価し、短期代謝ベースの増殖アッセイよりも生物学的関連性が高く、より明確な結果を提供します。今後の研究では、このプロトコルを追加のLncRNAや腫瘍モデルに拡大し、がん細胞増殖の可能性を体系的に調律するメカニズムを探る予定です。