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著者らは、Seurat、Giotto、およびSPOTlightパッケージの開発者および maintainer の皆様によるサポートとドキュメント提供に感謝いたします。また、公開データリポジトリおよび、データセットを寛容に共有してくださった研究者の皆様の貢献に深く感謝いたします。

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

本プロトコルでは、解析の深度と実用的なアクセシビリティを両立させた、空間トランスクリプトームデータ解析のための包括的な計算ワークフローを提供します。ステップバイステップのアプローチにより、初期のデータ取得から高度な空間解析に至るまでの完全な解析パイプラインを研究者に提示し、同時に重要な意思決定ポイントや潜在的な落とし穴についても強調して解説します。
本プロトコルのいくつかのステップは、後続の結果に大きな影響を与えるため、特に注意が必要です。品質管理およびフィルタリングのしきい値は、特定の組織型やテクノロジープラットフォームに合わせて慎重に調整する必要があります。フィルタリングが厳しすぎると生物学的に重要なスポットが除去される可能性があり、逆にしきい値が緩すぎるとテクニカルノイズが混入する可能性があるためです。また、正規化手法の選択は、その後のクラスタリングおよび差異発現解析の結果に大きく影響します。例えば、本パイプラインでは標準的な対数正規化（log-normalization）ではなくSCTransformを使用しています。これは、SCTransformがシングルセルおよび空間解析ワークフローにおいて、シーケンス深度などのテクニカルエフェクトに関連する技術的変動をモデル化し、低減させることが報告されているためです14,15。統合（integration）の際、統合機能（integration features）と解像度パラメータの選択については、統合の強度と生物学的シグナルの保存のバランスを維持するために慎重な検討が必要です。空間的に変動する遺伝子の同定（spatially variable gene calling）については、計算上のスケーラビリティと、アレイベースのデータにおける空間的自己相関分析への適合性からMoran's Iを選択しましたが、データセットのサイズや研究目的に応じて、SPARKなどの代替手法を検討することも可能です16。
このワークフローのトラブルシューティング項目では、あるパッケージから次のパッケージへ出力を渡す際に発生する一般的な相互運用性の問題に焦点を当てています。単一の汎用的な変換ステップに頼るのではなく、本ワークフローでは各ソフトウェアインターフェースにおいて最適化されたフォーマット変換を行います。具体的には、Seuratでの統合前に空間カウントデータを標準的なRNAアッセイスロットにコピーし、SeuratおよびシングルセルリファレンスオブジェクトをSPOTlight用のSingleCellExperimentオブジェクトに変換し、空間カウント行列をSTdeconvolve用に再フォーマットします。また、細胞間コミュニケーション解析のために、Seurat由来のカウント、座標、および細胞型メタデータをGiottoオブジェクトに変換し、Select Spatial SpotsによるROIアノテーションを、Seuratオブジェクトに再マッピングできるようCELL_ID、X/Y座標、およびグループラベルを含むCSVファイルとして書き出します。これらのステップにより、ユーザーは、互換性のないアッセイスロット、不一致のスポット識別子、不足しているメタデータ列、不正確な座標フォーマット、およびリガンド・レセプターの遺伝子シンボルの不一致といった一般的な問題を特定し、修正することが可能になります。
このワークフローのさらなる特徴は、単一のアルゴリズムに依存せず、2つの相補的なデコンボリューション戦略を利用している点にあります。SPOTlightは、細胞型の割合をリファレンスに基づいて推定するために既知のscRNA-seqリファレンスを使用しますが、一方でSTdeconvolveは、リファレンスを用いない潜在的な転写トピックの抽出を可能にします。デモンストレーションデータセットにおいて、STdeconvolveのトピックは組織学的に定義された領域と一致し（図5B）、生物学的な解釈可能性が裏付けられました。本プロトコルでは、これら2つの手法の直接的な定量比較は行っていません。自身のデータでベンチマークを行いたいユーザーは、プロトコルのステップ7.3.2に記載されたフレームワークに従ってください。さらに、本プロトコルでは、コア機能にスクリプトを使用することでユーザビリティとトレーサビリティを確保しつつ、直感的なROIの切り出しを可能にするグラフィカルインターフェース（Select Spatial Spots）を提供しています。
SeuratとGiottoを連携させることで、Seuratベースの前処理および統合と、Giottoベースの空間統計およびネットワーク解析を組み合わせたワークフローが可能になります。SeuratはscRNA-seqの経験を持つ研究者にとって確立された環境を提供し、マルチサンプルの統合をサポートします。一方、調和させたデータをGiottoに転送することで、空間ネットワークの構築やリガンド-受容体解析が可能になります。この設計により、ユーザーは両プラットフォームの実証済みの強みを活用できますが、本プロトコルにおいてSquidpyや他のフレームワークとのベンチマーク評価を行ったことを意味するものではありません。細胞間コミュニケーションに関しては、Giottoのドロネーネットワーク（Delaunay network）に基づくリガンド-受容体推論を使用しました。これは、同一の解析環境内で空間的な隣接性を組み込めるためです。CellChatなどのフレームワークは広範なシグナリングデータベースを提供していますが、本プロトコルでは評価していません17。
いくつかの制限を考慮する必要があります。リファレンスベースのデコンボリューションアプローチは、高品質で一致したシングルセルリファレンスの利用可能性に決定的に依存します。さらに、細胞間相互作用解析の根底にある基本的仮定は、転写物の共発現を物理的なタンパク質相互作用の代用としているため、その後の実験的検証が必要です。最後に、このワークフローは主に標準的なVisiumデータセットを中心に開発されました。Visium HDのようなニアシングルセル解像度の技術に向けて分野が進展するにつれ、解析上の考慮事項は変化します。より高解像度のデータでは、異なる前処理パラメータが必要となる可能性があり、スポットデコンボリューションの絶対的な必要性が低下する可能性があります。このワークフローをVisium HDデータセットに適応させるには、高解像度のビンを計算的に統合してより大きな空間ビンにするか、あるいはスポットデコンボリューションモジュールをバイパスして画像ベースの細胞セグメンテーションを採用することができます18。
これらの機能は、発生生物学、神経科学、がん研究、免疫学など、さまざまな生物学的領域への適用可能性を示唆しています19,20,21,22。モジュール設計により、研究者は空間ドメインの同定、細胞間通信、または領域的な特殊化など、自身のニーズに合わせて特定のコンポーネントを適応させることが可能です。空間技術が進化し、データセットが拡大し続ける中で、本プロトコルは、新しい分析手法を取り入れ、新たな生物学的疑問に対処するための基盤を提供します。

空間トランスクリプトミクス（ST）は、組織切片内におけるメッセンジャーRNA（mRNA）分子の空間座標を保持したまま、ゲノムワイドな遺伝子発現を測定する革新的な技術群である。ST法には、位置バーコード化アレイを用いるシーケンシングベースのアプローチと、完全な組織微小環境内で転写シグナルをマッピングするin situイメージングアプローチが含まれる1,2。空間的なコンテキストを保持することで、STは組織構造、細胞近傍の組織化、細胞間コミュニケーション、および組織解離後では十分に解明できない微小環境に関連する生物学的プロセスの解析を可能にする3。
公開STデータリポジトリの急速な拡大により、二次解析や手法開発においてかつてない機会がもたらされています3。CROSTデータベースなどのリソースは、複数の種や技術プラットフォームにわたる数百の空間分解能トランスクリプトームデータセットをキュレートしており、一方でSTOmicsDBのような特化型のコレクションは、Stereo-seqなどの特定の解析手法に焦点を当てています4,5。このようなデータの豊富さがあるにもかかわらず、空間データ構造の複雑さ、解析ツールの多様性、および再現可能なワークフローを実装する上での技術的ハードルにより、計算解析は依然として困難な課題となっています6,7,8,9,10,11。
単一のソフトウェア環境に依存することによる制限を解消するため、相補的な解析ツールを活用した統合的な計算ワークフローを本稿で提示します。既存の包括的なST解析エコシステムには、主にSeurat、Giotto、およびSquidpy6,7,12などのPythonベースのフレームワークが含まれます。SquidpyのようなPythonベースのツールは空間グラフ解析において広範な機能を提供していますが、主要な計算パイプラインを単一のプログラミング言語環境に集約することで、言語間での技術的な障壁を最小限に抑えることができます。したがって、言語間の技術的障壁を軽減するため、コアパイプラインは主にRで実装されています。このRベースのワークフローにおいて、シングルセルおよび空間トランスクリプトームのワークフローで一般的に使用されているSeuratを、データの読み込み、品質管理、正規化、次元削減、可視化、およびマルチサンプルの統合に使用します。その後、Giottoを用いて空間ネットワークの構築およびリガンド・受容体に基づく細胞間通信解析を行います。このように、本パイプラインはSeuratによる前処理および統合とGiottoによる空間解析を連携させ、2つのツールセット間のデータ転送を明示的かつ再現可能な形式で維持しています。
このフレームワークでは、2つの相補的なデコンボリューション戦略が実装されています。1つはscRNA-seqデータを使用して細胞型の比率を推定するリファレンスガイド法であるSPOTlightであり、もう1つは潜在的な転写パターンを特定する非教師ありトピックモデリング法であるSTdeconvolveです8,11。これらの出力は空間的な細胞不均一性の相補的な視点を提供しますが、ユーザーがプロトコルに記載されている任意の整合性解析を行わない限り、定量的なクロスバリデーションとしては扱われません。また、インタラクティブな関心領域（ROI）アノテーション用のカスタムPython DashアプリケーションであるSelect Spatial Spotsが統合されており、以降のダウンストリーム解析に使用可能な標準的な座標ベースのアノテーションファイルをエクスポートします。
実用性に関しては、本ワークフローは主に標準的なアレイベースのSTデータ（例：解像度 55 µm のVisium）を対象としており、パラメータの評価後に他の組織型へ適応させることが可能です。解析前に、主要な制限事項を考慮する必要があります。第一に、参照ガイド付きデコンボリューションモジュールは、高品質で組織が一致したscRNA-seqリファレンスに依存します。第二に、サブセルラーまたはシングルセルに近いプラットフォームでは、統合前に前処理の変更、空間的なビンの集約、または画像ベースの細胞セグメンテーションが必要になる場合があります2。代表的なマウス結腸データセットは、本ワークフローが空間ドメインおよびマーカーで定義された組織構成をどのように評価できるかを示すデモンストレーションとして使用されており、あらゆるプラットフォームへの汎用的な互換性を証明するものではありません。

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>高度なデータ可視化</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>空間ネットワークおよび細胞間コミュニケーション解析</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>プロットの合成および配置</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>v4.4.3</td><td>コア実行環境 (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>シングルセル品質管理および可視化</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>シングルセル分散モデリングおよびマーカー検出</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (カスタムPythonツール)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>インタラクティブな空間関心領域 (ROI) 選択 (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>空間データの前処理、統合、およびクラスタリング</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>シングルセルおよび空間データ用データ構造</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Bioconductor Core Team</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>scRNA-seq用標準データコンテナ</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>リファレンスガイド付き空間デコンボリューション</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Jean Fan Lab</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>教師なし潜在トピックモデリング</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>コアデータ操作およびフォーマットスイート</td></tr></tbody></table>

空間トランスクリプトームデータ解析の実践的ワークフロー：データ取得から高度な解析まで

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

空間的トランスクリプトーム解析（ST）は、組織切片内におけるmRNA分子の2次元的な空間的コンテクストを保持したままゲノムワイドな遺伝子発現をプロファイリングする手法であり、組織構造や微小環境に関連する生物学的研究を可能にします。しかし、データのインポート、品質管理、統合、デコンボリューション（逆畳み込み）、空間統計、および可視化には、多くの場合、複数のソフトウェア環境と再現可能なパラメータ選択が必要となるため、ST解析は依然として困難な課題となっています。本プロトコルでは、公開STデータセットを用いたRでの実用的な計算ワークフローを提示します。具体的には、データの取得とソフトウェアのセットアップから始まり、Seuratに基づくデータの読み込み、品質管理、正規化、複数サンプルの統合、クラスタリング、および空間可変遺伝子解析までを順に説明します。その後、リファレンスガイドに基づくSPOTlight解析や、教師なしのSTdeconvolveトピックモデリングを含む相補的なデコンボリューション戦略を適用し、続いてGiottoを用いた空間的な細胞間相互作用解析と、カスタムPython Dashアプリケーションを使用したインタラクティブな関心領域（ROI）の選択を行います。スクリプトベースの実行、明示的なパラメータの根拠、期待される出力、およびトラブルシューティングのチェックポイントを重視することで、本プロトコルは、データセットおよびプラットフォーム固有のパラメータ評価を経た後、標準的なアレイベースのSTデータセットおよび関連プラットフォームに適応可能なフレームワークを提供します。

ワークフローの実装とデータ統合により、組織の主要な特徴が明らかになる
解析ステージごとの期待される出力を示すために、マウス大腸の空間トランスクリプトームデータにこの計算ワークフローを適用した。ワークフローの概略図（図1）に示すように、パイプラインはデータの取得と品質管理から始まり、空間特徴プロットによって組織の境界を画定した（図2A,B）。次に、解釈可能な生物学的変動を維持しつつ技術的なバッチ効果を低減させるため、Seuratのアンカーベースの統合ワークフローを用いた。統合後のUMAP可視化により、サンプルのアライメントと空間的なクラスターパターンが示された（図2C,D）。次元削減および後続のクラスター分析を導くため、累積分散に基づく主成分（PC）の定量的かつ動的な選択を実装した（付録図1を参照）。マーカー遺伝子のヒートマップ解析により、空間クラスターの背景にある明確な転写プロファイルが示された（図2E）。
計算上のクラスターが結腸組織学の既知の解剖学的構造と一致しているかを確認するため、代表的な層特異的マーカー遺伝子の発現プロファイルを評価した。粘膜上皮層では、EpcamおよびKrt8を含む上皮細胞マーカーと、杯細胞マーカーであるMuc2の発現が認められた。Col1a1やVimなどの間葉系およびストローママーカーは固有層および粘膜下層領域を示し、一方で外側の固有筋層はActa2やTaglnなどの平滑筋構造遺伝子によって示された。これらのリネージ関連マーカーの空間的な局在は、統合およびクラスター化のワークフローが、粘膜から筋層に至る軸に沿った結腸組織の主要な組織学的層構造を維持していたという解釈を裏付けている（付随図 2を参照）。
クラスターの検証後、実験条件間での変動的に発現している遺伝子（DEG）を特定するために、ダウンストリームの差分的発現解析を実施した（Figure 2F,G）。さらに、Moran's I統計量を用いて空間的変動遺伝子を特定し、組織全体で有意に非ランダムな空間分布を示す遺伝子を明らかにした（Figure 2H）。
細胞デコンボリューションと空間相互作用ネットワークによる組織の微細構造の解明
シングルセルRNA-seqリファレンスデータの処理により、QCフィルタリング（図 3A）、教師なしクラスタリング（図 3B）、マーカー遺伝子の検証（図 3C）、および独立したアノテーションとの一致（図 3D）によって支持されるアノテーションが得られた。細胞組成（図 3E）に基づき、デコンボリューションのためのダウンサンプリング戦略を決定した。SPOTlightを用いて、空間スポット全体のリファレンスガイド付き細胞型割合を推定し（図 4A,B）、一方でSTdeconvolveを用いて、空間的な細胞パターンの教師なしトピックモデリングビューを提示した（図 5B）。カスタムのSelect Spatial Spotsツールにより、これらのパターンの組織学的コンテキストを提供した（図 5A）。最後に、デコンボリューションされた細胞型割り当てを用いて、空間通信解析を行い、空間的に近接する細胞型グループ間のリガンド-受容体相互作用を特定した（図 6A,B）。
プロトコル最適化におけるトラブルシューティングの観察結果
プロトコルの最適化過程において、実用的なチェックポイントの根拠となるいくつかの課題が特定されました。シングルセルリファレンスが組織のコンテキストと十分に一致していない場合、デコンボリューションの結果が不十分になることがあり、利用可能な場合は組織および種が一致したscRNA-seqデータを使用する必要があることが示されました。デフォルトのパラメータを用いた初期のクラスタリングでは、期待される生物学的構造が必ずしも解明されないことがありました。PCの選択、クラスタリングの解像度、およびマーカー遺伝子のコヒーレンスを確認することで、組織解剖学と一致し、空間的に解釈可能なドメインを特定することができました。これらの観察結果は、ワークフローの実行中にユーザーが一般的な解析上の問題をどのように診断できるかを示す実用的な例となります。
<img alt="scRNA-seqデータ解析ワークフロー図。プロセス：正規化、統合、クラスタリング。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図1"> 
図1統合的空間トランスクリプトーム解析のワークフロー。 データ収集および前処理から高度な空間解析に至るまでの解析パイプラインの概略図。主な工程は以下の通りである：(1) Seuratを用いたデータの読み込み、品質管理、および複数サンプルの統合、(2) 空間クラスタリングおよび空間変動遺伝子の検出、(3) 細胞型のデコンボリューション 〜経由で リファレンスベース（SPOTlight）および教師なし（STdeconvolve）の手法；(4) Giottoを用いた空間的な細胞間相互作用解析と、カスタムツールを用いたインタラクティブな関心領域（ROI）の選択。 空間スポットの選択すべてのモジュールの結果を統合し、組織構造および細胞微小環境に関する生物学的な知見を導き出します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="バイオリンプロット、t-SNEクラスタリング、ボルケーノプロット、およびヒートマップデータを用いた空間トランスクリプトーム解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図2"> 
図2データの統合、クラスタリング、および差分的発現解析。 (A、B) 空間サンプルA1およびB1の品質管理指標。遺伝子数、UMI数、およびミトコンドリア遺伝子率の分布を示す。 (C) 統合された空間トランスクリプトームデータのUMAP可視化。サンプル由来（左）およびクラスターアイデンティティ（右）で色分けしている。 (D) 組織切片上へのクラスターアイデンティティの空間的投影。 (E) 各空間クラスターにおける上位マーカー遺伝子のヒートマップ。 (F）条件A1_colon_d0とB1_colon_d14の間で差的に発現している遺伝子を示すボルケーノプロット。 （G) 組織切片における代表的な変動遺伝子の空間的発現パターン。（H同定された上位の空間的に変動する遺伝子の空間発現マップ 経由で Moran's I統計量。左側の2つのパネルはサンプルA1_colon_d0の遺伝子を、右側の2つのパネルはサンプルB1_colon_d14の遺伝子を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="scRNA-seq解析：バイオリンプロット、UMAPクラスター、細胞型スコア、および棒グラフによる分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 3"> 
図3シングルセルリファレンスデータの処理およびアノテーション (A) フィルタリング前後におけるscRNA-seqリファレンスデータの品質管理指標。 (B) 非教師ありクラスターで色分けしたscRNA-seqデータのUMAP可視化。(C) 各クラスターにおける標準的な細胞型マーカー遺伝子の発現スコアを示すドットプロット。（D) 主要な細胞型をラベル付けした、scRNA-seqデータの注釈付きUMAP可視化図。 (E) scRNA-seqリファレンスデータセットの細胞組成。赤色の破線は、計算効率と細胞型の代表性のバランスを維持するために、SPOTlightデコンボリューション中に適用されたダウンサンプリング閾値（1細胞型あたりn = 50細胞）を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">こちらの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="細胞型の分布、顕微鏡画像；組織におけるB細胞、内皮細胞、線維芽細胞の解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 4"> 
図 4: 細胞異質性の空間的デコンボリューション。(A,B) SPOTlightデコンボリューションによる空間的スキャッターパイプロット。サンプルA1 (A) および B1 (B) の各スポットにおける主要な細胞型の構成比率を示す。(C) サンプルA1（左）および B1（右）におけるB細胞の代表的な空間分布。デコンボリューションを通じて同定された特定の免疫細胞集団の空間的に分解された局在パターンを示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="空間的遺伝子発現解析。組織切片における細胞型とピクセルグループを示すダイアグラム。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 5"> 
図 5: インタラクティブな関心領域解析と教師なしデコンボリューションの比較。(A) カスタムツール「Select Spatial Spots」のインターフェース。近位結腸、遠位結腸、およびその他の組織ドメインに対応する領域のインタラクティブな選択を示している。(B) サンプル A1 における教師なしデコンボリューション（STdeconvolve）結果の空間的スキャッターパイ可視化。スポットは(A)で手動アノテーションされた領域に基づいて色分けされており、組織学的なアノテーションと計算によって導出された細胞トピック分布との対応関係を示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
<img alt="リガンド受容体相互作用とlog2fc値を示す細胞間コミュニケーションチャート。バブル図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 6"> 
図 6: 空間情報に基づいた細胞間コミュニケーションネットワーク。(A,B) Giottoにより推定された、サンプルA1 (A) およびB1 (B) のリガンド受容体相互作用ネットワーク。ノードは細胞型を、エッジは有意なリガンド受容体ペア (FDR &lt; 0.05) を表し、エッジの太さは相互作用の強度に対応している。比較可能性と可視化の明瞭性を確保するため、すべてのサンプルに統一された有意性しきい値 (FDR &lt; 0.05) を適用し、各条件についてlog2FCでランク付けされた上位20個の相互作用を表示している。これらのネットワークは、結腸組織の空間的コンテキストにおける細胞型特異的なコミュニケーションパターンを強調している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
補足図1：次元削減におけるパラメータ最適化の定量評価。エルボープロットは、主成分（PC）の最適な数を動的に選択するためのワークフローのプログラム的手法を示している。この選択は、累積標準偏差および限界分散の閾値（赤色の垂直線で表示）に基づいて算出されており、後続のクラスタリングに先立ち、技術的なノイズを軽減しつつ生物学的な分散を捉えることを目的としている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">こちらのリンクをクリックしてファイルをダウンロードしてください。</a>
補足図2：結腸の層特異的な標準マーカーを用いた空間クラスタリングの検証(A) 計算上の各クラスターにおける上皮、ストロマ、平滑筋マーカーの濃縮発現を示すドットプロット。(B) 代表的なマーカー（Epcam、Col1a1、Acta2）を組織座標にマッピングした空間特徴プロット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。</a>

本プロトコルでは、空間トランスクリプトームデータの解析に向けた再現可能なワークフローを提示します。公開データの取得から、Seuratを用いた品質管理、データの統合、空間的特徴の検出、細胞型のデコンボリューション、関心領域（ROI）のアノテーション、そして細胞間相互作用の解析に至るまでの手順を、透明性のある実行を支援する実用的なチェックポイントと共に解説します。

空間トランスクリプトーム解析（ST）は、組織内におけるmRNA分子の二次元的な空間的コンテキストを維持しながら、ゲノムワイドな遺伝子発現をプロファイリングする手法である。

皆さん、こんにちは。このビデオでは、データの取得と読み込みから、基本的な探索、そして最終的な高度な解析まで、空間トランスクリプトーム解析の実際的なデータ解析パイプラインについて解説します。全体として、ワークフローは主に3つのステップで構成されています。まず、データのダウンロードを行い、次に解析コードを入手し、最後にパイプラインを実行して結果を生成します。ステップ1では、データの取得とディレクトリ構造の準備を行います。まず、公開されている空間トランスクリプトームデータセットを入手します。rawデータのアーカイブをダウンロードします。そして、アーカイブを解凍します。ファイルを標準化されたディレクトリ構造に整理します。まず、メインのデータディレクトリを作成し、次に各サンプル専用のサブディレクトリを作成します。各サンプルの必須ファイルを、それぞれのサブディレクトリに転送します。その後、各サンプルディレクトリ内に空間（spatial）サブフォルダを作成してください。以下のファイルをspatialサブフォルダに配置します。フィルタリング済みのfeature PC metrics S1ファイルをサンプルのメインサブディレクトリに配置します。spatialフォルダ内のgzipファイルを展開します。元のファイル名がload 10X spatial関数の要件と完全に一致していることを確認してください。ステップ2は、ソフトウェア環境のセットアップです。ここではR言語のインストールは省略し、GitHubリポジトリから解析スクリプトを取得する工程から説明を開始します。ファイルコンダクター内にあるGrahamからの必要なRパッケージを、setup Rスクリプトを実行してインストールします。公式ドキュメントシートに記載されているインストールコマンドを実行し、auto suitをインストールします。公式のインストールURLにアクセスし、セットアップスクリプトを取得してください。セットアップページの指示に従い、必要なPython環境とシステム依存関係を初期化します。GitHubリポジトリにアクセスしてカスタムツールを入手し、ソースコードをダウンロードします。TOSディレクトリに移動し、Pythonの依存関係をインストールします。ステップ3では、空間データの読み込みと品質管理を行います。空間データをSeuratオブジェクトに読み込みます。read 10X imageを使用して、高解像度の組織画像を手動でロードします。その際、画像ファイルのパスと画像名を指定してください。imageパラメータに前ステップで作成した画像オブジェクトを設定し、load 10X spatialを使用してSeuratオブジェクトを作成します。品質管理指標を算出します。percentage feature setを用い、パターンをmtに設定してミトコンドリアリードの割合を計算します。QC指標に基づいてデータを可視化し、解釈します。バイオリンプロット関数を用いて、nCount_Spatial、nFeature_Spatial、およびpercent.mtのバイオリンプロットを生成します。空間的特徴プロットを用いて、これらの指標の空間的特徴プロットを作成します。そして、組織領域外のスポットを特定します。オプションとして、低品質のスポットを除去するためのフィルターを適用します。スクリプトを実行すると、QCメトリクスや特徴量の空間プロットを含むこれらの結果を得ることができます。ステップ4は、データのプリプロセッシング、統合、およびクラスタリングです。個別のサンプルのプリプロセッシングにおいて正規化を行います。Spatialアッセイを用い、各サンプル個別にSC transform正規化を適用します。複数のサンプルを統合します。統合のために、SCTransform正規化済みオブジェクトのリストを準備します。空間アッセイをコピーして、各オブジェクトにRNAアッセイがあることを確認します。PREP SCTインテグレーションにおいて、select integration featuresを用いて共通の変動特徴量を特定します。正規化手法にSCTを指定して、find integration anchorsを用いてインテグレーションアンカーを検出します。IntegrateDataを用いてデータを統合します。統合されたアッセイでクラスタリングのための次元削減を行います。runPCAを使用して、統合データに対してPCAを実行します。累積寄与率を算出することで、下流解析に用いる主成分の最適な数を決定します。プログラムを用いてエルボー点（変曲点）を特定してください。決定した主成分数を用いてUMAPを実行します。FindNeighborsおよびFindClustersを用いて細胞のクラスタリングを行います。決定したPCを指定し、resolutionを0.5に設定します。FindMarkers関数を用いて、ターゲットグループ間の差分発現解析を実施します。空間的に変動する遺伝子を特定します。各オリジナルサンプルについて、SCTアッセイでMoran's I法を用いてfind spatially variable featuresを実行し、空間的自己相関を算出します。このスクリプトを実行すると、エルボープロット、UMapプロット、クラスタープロット、クラスターマーカーのヒートマップ、ボルケーノプロット、空間的特徴を持つ差異発現遺伝子、空間的に信頼性の高い遺伝子、および結腸層マーカーを取得できます。そして、結腸層マーカーのドットプロットと、空間的特徴プロットにおけるマーカーです。ステップ5、単一細胞リファレンスデータのプリプロセッシング。read 10Xを用いて単一細胞RNA-seqカウント行列を読み込み、Seuratオブジェクトを作成します。標準的なQC正規化およびデクラスタリングを行います。フィルター後の細胞におけるミトコンドリアリードの割合を算出します。SC transformを用いてデータを正規化します。vara.to.を設定し、percent.mt.を回帰させます。PCAおよびUMapを実行し、前のステップで説明した動的PC選択法を用いて細胞をクラスタリングし、その後、細胞型をアノテーションします。AddModuleScoreを使用して、標準的な細胞型マーカー遺伝子のモジュールスコアを算出します。モジュールスコアと既知の生物学的知見に基づいてクラスターをアノテーションします。あるいは、メタデータから事前に計算されたアノテーションをインポートすることも可能です。このスクリプトを習得することで、QC指標を取得できます。クラスターごとのUMap、サンプルごとのUMap、および細胞型スコアがアップロードされています。ステップ6は、SPOTlightを用いたリファレンスガイド下デコンボリューションです。まず、SPOTlight用のデータを準備します。アノテーション済みのシングルセルSeuratオブジェクトと空間的Seuratオブジェクトを、single-cell experimentオブジェクトに変換します。LogMoreCountsを用いて、シングルセルデータをログ正規化します。次に、SPOTlightデコンボリューションを実行します。まず、ModelGeneVarを用いて単一細胞データの高変動遺伝子を特定します。その後、スコアマーカーを用いて細胞型マーカーを算出し、高品質なマーカーでフィルタリングを行います。計算時間を短縮するため、各細胞型のシングルセルリファレンスを管理可能な数までダウンサンプリングします。SPOTlight関数を用いてデコンボリューションを実行し、シングルセルリファレンス、空間データ、マーカーリスト、およびHVGを指定します。その後、結果を可視化およびエクスポートできます。デコンボリューションの結果は、図に示すようなスキャッターパイプルートとして取得できます。ステップ7では、Stdeconvolveを用いた教師なしデコンボリューションを行います。まず、空間データを準備します。countsスロットを指定してGetAssayDataを使用し、空間Seuratオブジェクトから行カウントメトリクスを抽出します。STdeconvolveから得られたクリーンカウントを用いて、低品質なスポットおよび遺伝子を除去します。restrict strict LDAを用いて、4つの遺伝子が最小スポット分率で発現しているフィルターの潜在的な細胞型を特定し、fitLDAを用いて広範なトピック数にわたる割り当てモデルを適用します。opt minを用いた最適モデルにより、最小の複雑性に基づいて最適なモデルを選択します。結果を分析し、可視化します。getBetaThetaを用いて、最適モデルの血清型比率（Theta）および遺伝子プロファイル（Beta）を抽出します。腐食トピックの生物学的解釈を加えるには、select spatial spotツールで作成した関心領域（ROI）のアノテーションをインポートしてください。これらのアノテーションを「with all topics」機能のグループパラメータとして使用してください。デコンボリューションされた細胞型の割合を空間座標にマッピングし、ROIごとにスポットを色分けしてプロジェクトに反映させます。スクリプトを実行すると、SPOTlightで生成されるものと同様の、スケールパイプロードのような結果が得られます。ステップ8、Giottoを用いた空間的な細胞間相互作用の解析です。まず、SeuratオブジェクトをGiottoオブジェクトに変換します。createGiottoObject関数を使用し、低カウント指標と空間座標を指定してください。Giottoオブジェクトの前処理を行い、デコンボリューションの結果を追加します。normalized Giottoを使用してデータを正規化し、セロタイプ注釈として追加します。addCellmetadataを使用して細胞メタデータを選択します。createSpatialNetworkを用いて空間ネットワークを作成します。リガンド受容体データベースを環境にロードします。explore CellCellcomを実行し、空間的に近接している細胞タイプ間の有意なリガンド受容体相互作用を特定します。このようにして、細胞間コミュニケーションのドットプロットを取得できます。ステップ9は任意です。SelectSpatialSpotを用いたインタラクティブなスポット選択を行います。スクリプトsixを用いて、インタラクティブツールのためのデータを準備します。GetTissueCoordinatesを使用して、Seuratオブジェクトから空間座標を抽出します。データを整形し、エクスポートします。整形したデータフレームをCSVファイルにエクスポートします。次に、関心領域（ROI）解析を行います。カスタムプログラムを起動してください。Spatial Spots Dashアプリケーションを選択し、CSVファイルを読み込みます。空間的な位置に基づいてスポットをインタラクティブに選択します。その後、選択したスポットのリストと割り当てられたグループを、新しいCSVファイルとしてエクスポートします。スクリプトを一つずつ実行して、どのような結果が得られるかを確認します。すべての結果は results five-fold に保存されます。ご覧の通り、QCメトリクスと divide を取得できます。こちらの空間的特徴プロットで確認できます。さらに、デコンボリューション処理は教師ありおよび教師なしの両方の手法で行われています。SPOTlightの結果はこちらです。ご覧のように、すべてのスポットに比率情報が含まれています。ここでは、STdeconvolveによる教師なしデコンボリューションの結果も生成されています。また、これは空間データにおけるスポットのSeuratクラスターの結果です。また、このように空間チームプロットで可視化することも可能です。さらに、Giottoを用いてスポット間コミュニケーションの結果を得ることもできます。このワークフロー全体は100%オープンソースです。発現指標から高度な空間モデリングに至るまでのスポット解析。すべての工程はRAM 16GBのマシンで動作します。コードベースはモジュール方式で、タスクごとに1つのスクリプトが割り当てられています。なお、このパイプラインはFASTQファイルからのアップストリーム処理は含んでいないことに注意してください。重点は2D空間データに置かれており、現在はVisiumのダウンローダーのみを搭載しています。以上です。ご視聴ありがとうございました。

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Research

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