マウス副腎皮質からのゾーン強化一次培養の確立

私の研究は副腎微小環境調節を調査し、帯球体および帯束の分化におけるACMおよびWntシグナル伝達、腫瘍発生に焦点を当てました。既存の手法では副腎領域を明確に区別できません。このプロトコルによりZGとZFが豊富化し、異なる細胞タイプの研究が可能になります。

このプロトコルはZGおよびZFにおける副腎生理学、ゾーネーションや細胞分化の研究に適用可能です。副腎を単離してゾーン増強一次培養を探すには、生後約6〜7週の若年成雄マウス10〜15匹を使用します。安楽死後、マウスを背側デキュビトゥス(背側デキュビトゥス)姿勢で無菌の平らな表面に置き、70%アルコールで動物の毛を消毒します。

ハサミを使って、腹部の鼠径部に最初に切開をします。切開を両側の胸に向かって外側に広げ、腹膜を露出させます。皮膚を慎重に引き戻す。

その後、腹部の筋肉を優しく引き戻して腔を露出させ、副腎の血管損傷を避けてはっきりと見えます。微生物汚染を最小限に抑えるために手術器具を交換しましょう。左腎の内側上部に位置する左副腎を、楕円形でピンク色をしており、その周囲は白色の脂肪組織に囲まれている。

鈍器を使い、隣接する臓器を慎重に移動させて副腎の視認性を高めます。ハサミを使って、周囲の脂肪組織のほとんどを短くコントロールされた切断で除去し、副腎を隔離します。副腎を直接掴むのは避け、カプセルの損傷を防ぎましょう。

すべてのサンプルが採取されるまで、分離した副腎を直ちにP60培養皿に入れ、10ミリリットルの予温DMEM F-12培地を含みます。次に、右腎臓の外側かつ上方に位置する右副腎を特定します。肝臓、上行結腸、近傍の血管に近接しているため、視認が困難になることがあります。腎静脈や腎動脈を慎重に扱い、誤って切ったり出血したりしないようにしましょう。

右副腎を分離した後、左副腎と同じ手順で両方の副腎を同じ皿に入れます。培養皿を70%アルコールで拭き取り、その後腺を層流フードに移します。その後、副腎を25度のPBSを含む皿に順次移して3回洗浄します。

最終洗浄後、分離組織を4皿目に預熱DMEMで採取・維持し、複数の腺の準備時に生存性を保ちます。副腎をろ過紙に移して解剖します。次に細かい鉗子を使い、付着する脂肪組織の副腎を掴みます。

カプセルを傷めないように、フィルターペーパーの脂肪を慎重に動かして切り分けてください。腺が滑らかで無傷で、過剰な脂肪や結合組織がないことを確認してください。副腎を慎重に新しいフィルターペーパーに移し、精密な微細解剖を容易にします。

細かい鉗子を使って、副腎の包を優しくつまみます。メスの刃を使って、組織を完全に切断せずに腺に橈骨切開を行ってください。切開部から皮質の内部成分を外側に排出するために、わずかな機械的圧力をかけます。

内腺物質を露出させつつ、カプセルと帯糸球体を鉗子の先端に繋げたままにします。排出された内腺物質は束帯および延髄であると特定します。すべての腺が処理された後にのみ酵素的消化を開始し、外側と内側のゾーンの適切な機械的分離を確保します。

遠心分離後、収集した細胞を再び培養培地に懸浮させます。副腎細胞培養を確立した後、遺伝子発現解析と免疫染色を用いて培養細胞の分子特性解析を行います。一次副腎細胞培養は、ゾナグロメルラ症細胞の外側部分とゾナ・ファシキュラータ細胞の内側部分から成功裏に確立されました。

系統追跡マウスモデルにより、Cyp11b2プロモーターによって駆動されるゾナグロミローサ特異的mGFP発現の可視化が可能となりました。mGFPの発現は主にゾナグロメロサ豊化培養で観察され、ゾナ・ファシキュラータ強化培養は主にmトマト発現が認められました。外側分画培養では、Cyp11b2、Dab2、Sonic hedgehogの相対的な発現レベルが内側分画培養よりも高く観察されました。

内側分画培養では、外側分画培養と比較してCyp11b1およびAkr1b7の相対的な発現が高かった。ゾナグロメロローサ富集培養では、ゾナ・ファシキュラータ富集培養よりもアルドステロン分泌量が高かった。外側分画培養では、アンジオテンシンII、カリウム、アドレノ皮質刺激ホルモンによる刺激により、アルドステロン分泌がさらに増加しました。

帯束斑豊富培養では、帯球体強化培養でコルチコステロン分泌量が高かった。ゾナ束括培養では、副腎皮質促進ホルモンおよびフォルスコリン刺激に反応してコルチコステロン分泌が増加しました。このプロトコルにより、ホルモン産生、シグナル伝達経路、細胞外マトリックスを含むゾーン特異的な生理学や分化の研究が可能になります。

今後の研究では副腎ゾーションや分化機構の探求、これらの細胞を用いて3Dモデルを構築し、ECM相互作用を研究することが期待されます。