無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション

単一細胞エレクトロポレーションは、組織を維持したまま個々の細胞にDNAやその他の高分子を導入できる特殊な技術であり、高度な生体内イメージング技術と組み合わせることで、in vivoでの調製も可能です。蛍光マーカーを単一細胞エレクトロポレーションすることで、数秒から数日という時間スケールにわたって、細胞形態、細胞増殖、および細胞間イベントを直接可視化できます。本ビデオでは、XUSオタマジャクシの未損壊脳内のニューロンに蛍光染料またはプラスミドDNAを単一細胞エレクトロポレーションする手順を詳しく説明し、蛍光ラベルされたニューロンのライブイメージングの例を示します。

こんにちは。私はEth Haaです。ブリティッシュコロンビア大学脳研究センターのKurt Haass博士の研究室に所属しています。本日は、アルビノのXenopus laevisオタマジャクシの生体脳内において、ニューロンを標的とした単一細胞エレクトロポレーションを行う方法を実演します。

この手法の明確な利点は、周囲の組織を変化させることなく個々の細胞に対して実験的操作を行えることであり、これにより、細胞自律的な効果と全体的な処置による効果を区別できる点にあります。最初のステップでは、適切な先端径とテーパー角を持つマイクロピペットを作製し、続いてマイクロピペットに移行物質を充填します。次に、TAプールを麻酔して固定チャンバーに移動させ、その後、マイクロピペットを脳内に挿入し、一連の電圧パルスを印加します。

最後に、標識されたニューロンを2光子顕微鏡でイメージングします。ここでは、オタマジャクシを用いたこの手法について説明します。単一細胞の標識は、ex vivo調製のみならず、他のモデルシステムにおいても利用可能です。

それでは、以上の点を踏まえて始めていきましょう。単一細胞エレクトロポレーションは、引き伸ばしたガラス製マイクロピペット電極を用いて個々の細胞を標的とする手法であり、ピペット先端に接触している単一の細胞にのみ電場を限定させます。ピペット先端の物理的な形状は、この技術の成否に直接影響を与える極めて重要な要素です。

ホウケイ酸ガラス（外径1.5 mm、内径0.75 mm）からマイクロピペットを作製するために、ソルダー社製モデルP 97 プラーを使用します。このガラスには、チップへの充填時に気泡が混入するのを防ぐための内部フィラメントが含まれています。単一細胞のエレクトロポレーションに最も効果的であると判明したピペットチップは、先端径が0.5～1 µmで、テーパー角が10度以上のものです。ガラスマイクロピペットの延伸後、バックフィリングまたは充填用シリンジを用いて、溶液中の移行物質をピペット内にロードします。

本デモンストレーションでは、ここに示されている蛍光染料、またはGFP（緑色蛍光タンパク質）をコードするプラスミドを用いて、単一ニューロンを蛍光標識します。ピペットに混入する粒子状のデブリを減らすため、GFP溶液は高速で短時間遠心分離してください。不慣れなユーザーの場合、チップが詰まる可能性が高くなるため、エピ蛍光顕微鏡下で容易に視認できる蛍光染料から始めることを推奨します。

これにより、サンプル内でのチップの視覚化が可能になり、装置が適切にセットアップされているか、またピペットチップが適切であるかについて直接的なフィードバックを得ることができます。これで準備は完了です。マイクロピペットの準備が整いましたので、単一細胞エレクトロポレーションの手順に進みます。

本手法に必要な電気設備は、刺激装置、オシロスコープ、およびピペットに挿入するための銀線が装着されたピペットホルダーです。ここではAxon Instruments社のAx Separator 800 Aを使用していますが、Grass SD9のような一般的な刺激装置でも代用可能です。Ax Separatorはヘッドステージに接続されており、ヘッドステージがAx Separatorと銀線電極の間でインターフェースとして機能します。

オタマジャクシ外部接地電極は、オタマジャクシとの電気的接触を維持するための単純な銀線です。エレクトロポレーション中、ヘッドステージ、接地リード、およびオタマジャクシ外部接地電極は、すべてオシロスコープの入力に接続されます。電気機器のセットアップが完了したら、ピペットをピペットホルダーに設置できます。

ピペットホルダーは、微細な移動が可能な3軸マイクロマニピュレーターに取り付ける必要があります。単一細胞エレクトロポレーションには、十分な作動距離を持つ顕微鏡が必要です。これにより操作スペースが確保され、ピペットを約30～45度の角度で導入することが可能になります。

装置の接続が正しく完了したら、単一細胞へのエレクトロポレーション手順を開始します。まず、オタマジャクシを0.02%MS 2, 2 2に浸して麻酔をかけます。通常、これによりオタマジャクシは完全に麻酔状態になります。約5分後、1匹のオタマジャクシをエレクトロポレーションチャンバーに移します。

プラスチック製転送ピペットを用いて、小さなシリコンブロックにオタマジャクシ型の空洞を彫り、チャンバー内にいる際にオタマジャクシの皮膚に接触するように銀の接地線を挿入することで、チャンバーを簡単に自作できます。次に、絵筆を使ってオタマジャクシの位置を調整し、背面が上になるようにします。その後、マイクロピペットを、目的領域に隣接する皮膚に接触するまで下げます。

ピペットをさらに下げていくと、最初は皮膚がわずかに窪み、その後、下層の組織へと貫通します。ここでは、タコ脳の視葉をターゲットにしています。具体的には、細胞体層の領域を狙っています。

xiを使用している場合は、組織内におけるピペットの抵抗値をモニタリングできます。一般的に、抵抗値は10から約40 MΩであれば良好に動作します。

ピペットの抵抗値は、チップの直径が小さすぎないか、あるいはチップが詰まっていないかを確認する優れた指標となります。チップが詰まっている場合は、抵抗値が高くなります。一方で、チップの直径が大きすぎる場合やチップが破損している場合は、ピペットの抵抗値は低くなります。ただし、従来の刺激装置を使用している場合、絶対抵抗値を測定することはできません。

オシロスコープの読み取り値は、蛍光デキストラン色素におけるピペット抵抗の間接的な測定値です。刺激は、300 Hzの周波数で印加される10ミリ秒の正方波パルス列で構成されています。個々のパルスの持続時間は300マイクロ秒であり、50 Vの電圧で印加されます。

これらの設定を用いることで、電極プローブ後の刺激印加時に、蛍光色素がチップから放出されることが確認できます。その後、ピペットを回収し、得られる量を増やすために組織内の異なる部位でこの工程を繰り返します。電圧パルス列の印加中は、オシロスコープで得られるパルスの振幅をモニターし、必要に応じて振幅を1～1.5 µAの間に調整してください。

電圧を大幅に上げた後でもパルス振幅が低いままである場合、または手順の途中で振幅が低下する場合、これはチップが詰まっているか、チップ径が小さすぎることを強く示唆しています。このような状況になると、非常に困難な場合があります。一方で、印加電圧を大幅に下げた後でも振幅が高いままである場合、または手順の途中で振幅が上昇する場合、これはチップが広すぎるか、あるいはチップが破損していることを強く示しています。

私はよく感情的になり、悲しくなることがあります。前述の通り、蛍光色素を使用する利点は、提示した刺激パラメータを用いて単一細胞にエレクトロポレーションが行われたかどうかを即座に確認できることです。細胞が非常に暗いか、あるいはラベルされた細胞が見られない場合は、ラベルされた細胞がこのように明るく光るまで、各刺激パラメータを個別に段階的に上げていくことから始めます。きれいにラベルされた細胞が見えると、とても幸せな気持ちになります。

一方で、多数の細胞がラベルされているように見える場合は、このように単一の細胞が明るくラベルされるまで、刺激パラメータを徐々に下げて調整します。明るくラベルされた細胞を確認できるのは、非常に達成感があります。プラスミドDNAの場合、使用するパルス列は、持続時間1 ms、周波数300 Hzの負パルスであり、パルス列の持続時間は500 msです。

エレクトロポレーション後、TAポールの個体を新鮮な飼育液に移すと、麻酔から速やかに回復します。通常、50から100匹のTAポールにエレクトロポレーションを行った後、次にご説明するスクリーニングに進むことができます。イメージング実験を開始する前に、正立型エピ蛍光顕微鏡を用いてエレクトロポレーションしたオタマジャクシを迅速にスクリーニングすることが有用です。

イメージングに適したニューロンを含むオタマジャクシを特定するため、オタマジャクシを麻酔し、シガーチャンバーに配置してカバーガラスで固定します。次に、個々のオタマジャクシの脳をエピ蛍光光下で迅速に観察し、蛍光標識された単一ニューロンが存在するかどうかを確認します。エピ蛍光光への過剰な曝露は、標識細胞を死滅させる光毒性を引き起こすため注意してください。したがって、細胞が蛍光光に曝露される時間は最小限に抑えるようにしてください。

デキストラン染料を用いる場合、スクリーニングはエレクトロポレーション後30分から行うことができます。しかし、時間を長く置くことで背景の蛍光レベルが低下することが分かっています。プラスミドの場合、DNAスクリーニングは通常、エレクトロポレーションから少なくとも12時間後に行われます。

私たちは、オタマジャクシの視蓋内のニューロンを蛍光標識するために、日常的に単一細胞エレクトロポレーションを用いています。当研究室の2光子顕微鏡はカスタムメイドで、Olympus FV 300共焦点顕微鏡とChameleon XPレーザー光源を用いて構築されています。通常、グリーン蛍光のイメージングには910 nanometersの波長を使用しています。

単一の標識されたALニューロンを持つオタマジャクシを見つけ、2光子顕微鏡装置に配置した後、異なる時間間隔で触覚ニューロンのタイムラプス2光子イメージングを行います。これにより、AL細胞の樹状突起の動的な成長パターンを観察することが可能になります。ここでは、単一細胞エレクトロポレーションを用いて標識された、GFP発現ニューロンの例を示します。

この画像は、神経細胞の成長を定量化するために生体内（in vivo）二光子顕微鏡を用いて撮影されました。通常、各神経細胞画像のスケルトン化された3次元再構成が作成されます。長い間隔を空けてタイムラプス撮影を行うことで、実験的な操作による長期的な影響を考察することが可能になります。

ここでは、樹状突起の分枝が形成されるまでの4日間にわたり、毎日イメージングを行ったGFP発現未熟ニューロンを示しています。これらの画像は2光子顕微鏡を用いて撮影され、Z投影として提示されています。高速タイムラプスイメージングを用いることで、樹状突起フィロポディアの形成と消失を含む、ニューロン成長のよりダイナミックなプロセスの性質を観察することが可能になります。

このビデオでは、1時間にわたり2分ごとに3次元撮像を行った、比較的成熟したGFP発現ニューロンを示しています。こちらは、1時間にわたり5分ごとに撮像した未成熟なGFP発現ニューロンの例です。若いニューロンは非常にダイナミックであり、広範な枝の伸展と退縮が見られます。

このGFP発現ニューロンの拡大図は、本システムにおける発達中のニューロンに典型的な、樹状突起フィロポディア（糸状仮足）の絶え間ない伸展と退縮を示しています。アルビノオタマジャクシの透明性と脳へのアプローチの容易さにより、このモデルシステムは、生体内でニューロンの成長や細胞内イベントを可視化するのに理想的に適しています。単一細胞エレクトロポレーションを用いることで、単一のニューロンの成長を可視化し、それ以外の部分は改変されていない脳内で細胞自律的な操作を行うことが可能になります。

以上で、zap lavis tat polesにおける単一細胞エレクトロポレーションの手法を説明しました。ここではTA polesへのエレクトロポレーションに焦点を当てましたが、この技術は他の生物や、海馬スライス、分散細胞培養においても用いられています。この手順を行う際は、高い収率を維持するために、ピペットチップと刺激パラメータを絶えず調整することが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。