Name: 無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-11T18:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 学ぶ単一細胞エレクトロポレーション法を神経科学に応用し、Xenopus laevisオタマジャクシの無傷脳内ニューロンに蛍光色素やプラスミドDNAを導入する技術。生体内で細胞形態と成長を可視化し、神経細胞の動的挙動を観察できる。

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著者は、SCE micromicropipetteチップの電子顕微鏡画像の未熟なニューロンとデレクダンフィールドの早送り動画キャプチャ成長のためSharminホセに感謝。

機器のセットアップ： <ol><li>この技法のために必要な電気機器は、刺激、オシロスコープ、およびマイクロピペットに挿入される銀のワイヤーを装着したマイクロピペットホルダーです。我々は一般的に軸索の楽器Axoporator 800A刺激を使用して、しかし、そのようなグラスの楽器のような他の一般的な刺激は、SD9刺激は、単一セルのエレクトロポレーションにも適しています。刺激は、内部の導電性溶液の入ったガラスのマイクロピペットの内部に配置される銀線電極とのインタフェースヘッドステージに接続されている。刺激装置から他のリードにもオタマジャクシ外部地面からの入力を受け取るオシロスコープの入力に接続されています。オタマジャクシ外部接地は、単純にエレクトロポレーション中にオタマジャクシと電気緊張接触したままで銀線です。マイクロピペットは、オタマジャクシと接触して置かれると回路が完了です。 </li><li>これが操作する余地を与え、マイクロピペットを約30-45度の角度で持ち込むことを可能にするため、単一細胞のエレクトロポレーションは、良いワーキングディスタンス（少なくとも5センチメートル）と顕微鏡が必要です。 </li></ol>マイクロピペットの作製： 適切なマイクロピペットの準備は、このプロトコルの重要なステップです。難しさは、組織を穿刺するときに容易に中断されませんいずれかの狭い先端（直径1μm以下）のバランスにあります。我々はまた、10度よりのテーパー角と先端が好ましいことを見出した。 <ol><li> 1μm以下の先端径を持つ引っ張らガラスのマイクロピペット、および10度よりも大きいの先端のテーパ角度を準備します。 <ol><li> 0.75ミリメートルの1.5ミリメートル、内径、外径と内部フィラメントとホウケイ酸ガラスは、この目的に適しています。 <ol><li>比較的厚いガラスは、先端部に剛性の程度を提供します。 </li><li>内部フィラメントは、マイクロピペットの先端に向かってバックで満たされた流体を描く上で重要です。 </li></ol></li></ol></li><li>適切なヒントの作製は、しばしば観察された結果に基づいていくつかの変更が必要になります。異なる組織がわずかに異なる形状や先端径を持つ先端が必要な場合があります。 </li></ol>単一細胞のエレクトロポレーションプロトコル： 新しいユーザーの場合、それは遺伝的に符号化された蛍光タンパク質とは異なり、彼らはすぐに落射蛍光で見ることができる、ので、蛍光デキストランの色素で開始することをお勧めします。蛍光色素の使用は、直接組織内にマイクロピペットの先端の位置を確認するために、ユーザーを可能にし、エレクトロポレーションした時点で機器が正しく設定されているかどうかに関して即座にフィードバックを与え、マイクロピペットの先端が適切であるかどうか。 <ol><li>どちらローディングシリンジを使用するか、バックを充填してエレクトロポレーションされる化合物の溶液をマイクロピペットを埋める。 <ol><li>プラスミドDNAを使用している場合は、水で調製した試料はエンドトキシンフリーであることを確認し、1-2μg/mlの間の濃度で。 </li><li>蛍光デキストランの色素の濃度は、経験的に決定されるべきである。私たちはしばしば約満たされたニューロンに水で希釈した蛍光色素を使用してください。 </li><li>通常は、0.5〜1μlののボリュームは十分です。 </li><li>ロードする前に、簡単に目詰まりにつながる可能性のあるマイクロピペットに引き込まれる粒子状破片の量を、減らすために高速でソリューションを遠心する。 </li><li>先端内の気泡は、多くの場合、現在の流れに影響を及ぼし、精力的にステージに取り付ける前にマイクロピペットをフリックすることで外れている可能があります。 </li></ol></li><li>ホルダーにマイクロピペットを挿入するか、ステージ3軸マニピュレータに取り付け。銀線電極をマイクロピペットに挿入されているか確認し、内部ソリューションとの電気緊張接触している。 </li><li>オタマジャクシ飼育培地（Steinbergの溶液、pH 7.4）で作成したMS - 222（3 - アミノ安息香酸エチルエステル）0.02％に浸漬してオタマジャクシを麻酔。 <ol><li>我々は通常、我々の実験ではステージ44から48アルビノアフリカツメガエルのオタマジャクシを使用してください。 </li><li>オタマジャクシは約5分後に通常完全に麻酔する。 </li><li>いくつかのオタマジャクシは、待機時間を削減すると同時に麻酔かもしれない、しかし、1時間を越える期間のMS - 222への暴露を避ける。 </li></ol></li><li>プラスチック製のトランスファーピペットを用いてエレクトロポレーションチャンバーに単一の麻酔オタマジャクシを転送します。 <ol><li>エレクトロポレーションチャンバーは、容易に®小さなSylgardでおたまじゃくしの形をした空洞を彫刻シリコンブロック、そしてそれはチャンバー内のオタマジャクシで電気緊張接触になるように空洞に銀のアース線を挿入することにより、社内で行うことができます。 </li></ol></li><li>湿らせた絵筆を使って位置オタマジャクシ背側を。 </li><li>それは、皮膚との接触に関心のある領域に直接隣接するまで、マイクロピペットを下ろします。 <ol><li>密集した細胞体との領域を標的にすることは大いに成功したエレクトロポレーションの可能性が増加します。我々は通常、オタマジャクシ視蓋をターゲットにしています。 </li><li> 30から45度の角度でのマイクロピペットをもたらす。急な角度はしばしば一つの視界を妨げないしながら浅く軌跡は、皮膚の穿刺をより困難なものにする。 </li></ol></li><li>続けマイクロピペットの低下は、最初に皮膚をディンプルし、基になる組織に通過します。 <ol><li>表層細胞は、in vivoイメージングのために好ましく、マイクロピペットの先端が皮膚のえくぼ形成によって徐々に低下していることを確認することでターゲットとすることができます。 </li></ol></li><li>一つは、常に一度に組織内に配置されたマイクロピペットの抵抗を監視する必要があります。 Axoporator 800A（アクソンインスツルメンツ）を使用している場合は、約10 -40mΩのの抵抗が最適です。抵抗は、先端の直径は、単一細胞電気穿孔法に適しているかどうかの良い指標です。 <ol><li>高マイクロピペットの抵抗（&gt;100MΩ）が狭すぎるのヒントが詰まってヒントまたはマイクロピペットを示すものである。 </li><li>低マイクロピペットの抵抗（&lt;10MΩ）は多くの場合、壊れた先端の結果が大きすぎる先端径の指標となる。 </li><li>直接抵抗測定を提供していない刺激を使用している場合は、マイクロピペットの抵抗を間接的にオシロスコープ（後述）によって測定される電圧パルスの振幅を観察することによって測定することができる。 </li></ol></li><li>電圧列車を適用します。 <ol><li>プラスミドDNAの場合、パルスは、訓練期間が1msの負の方形波パルスで構成される最も有効であることが判明し、500ミリ秒のパルス列の持続時間で300Hzので配信。 <ol><li>パルス電圧をオシロスコープで測定したパルスの振幅が0.75と1.5μAの間にあることが経験的にそのように決定されます。 </li></ol></li><li>蛍光デキストランの染料の場合は、300μsの期間の正の方形波パルスは10msのパルストレインの期間で300Hzの周波数で供給されています。 <ol><li> DNAのためのプロトコルと同様に、パルス電圧をオシロスコープで測定したパルスの振幅が0.75と1.5μAの間にあることが経験的にそのように決定されます。 </li><li>刺激のパラメータに追加の調整は、落射蛍光下でエレクトロポレーションの結果を観察に基づいて行うことができる。 <ol><li>エレクトロポレーションした細胞が暗く表示される場合、細胞が明るく表示されるまで、パルスパラメータは徐々に大きくする必要があります。 </li><li>細胞のクラスターラベルが付けられている場合、単一の細胞が標識されるまで、その一方で、、パルスパラメータを減らす必要があります。 </li></ol></li></ol></li></ol></li><li>マイクロピペットを撤回、組織内の別のサイトに再挿入、および電圧列車を適用する。 <ol><li>歩留まりを向上させるために、我々は一般的に標識された細胞が重複しないことを保証するために十分な間隔でオタマジャクシ視蓋の各半球で複数のサイトをエレクトロ。 </li></ol></li><li> Steinbergの飼育剤の容器中にエレクトロオタマジャクシを転送する。 <ol><li>オタマジャクシは、急速に数分以内に麻酔から回復します。 </li></ol></li><li>同じマイクロピペットは、多数のオタマジャクシに使用することができます。常にオシロスコープで測定したパルスの振幅を観測することが重要です。 <ol><li>大幅にパルス強度を増加した後、パルス振幅が低いままなら、これは可能性が一気に多くのオタマジャクシをelectroporatingする際によく見られる目詰まりしている先端の結果です。 <ol><li>マイナーチップ詰まりを取り除くために、方法は、組織にマイクロピペットを挿入した後、単一の正のパルスを適用することです。 </li><li>詰まりが外れ、または頻繁に再発を詰まらせることができない場合は、マイクロピペットを交換してください。 </li></ol></li><li>パルスの振幅が大幅にパルスパラメータを減少した後非常に大きいままの場合、これはチップが壊れ、交換が必要になっているサインです。 </li></ol></li></ol>成功したエレクトロポレーションした細胞のスクリーニング： <ol><li>エレクトロポレーション後、オタマジャクシは直立落射蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞についてスクリーニングされる。 </li><li>蛍光色素の場合には、オタマジャクシは30分ほど後にエレクトロポレーション後にスクリーニングすることができる。 <ol><li>我々は、より長い間隔が低く、バックグラウンド蛍光レベルに関連付けられていること、しかし、発見した。 </li></ol></li><li>遺伝的に符号化された蛍光タンパク質については、スクリーニングは通常、少なくとも12時間後にエレクトロポレーションを実施しています。 <ol><li>蛍光タンパク質を発現する細胞が時間とともに明るく取得していく、そのため、薄暗い細胞は12-24時間のさらに他のインターバル後に再スクリーニングすることができる。 </li></ol></li><li>上記のようなオタマジャクシはSylgard ®チャンバー内に設置し、封入、麻酔する。個々のオタマジャクシは、落射蛍光で観察されています。 <ol><li>落射蛍光光への過度の曝露は標識細胞を殺すことができる光毒性になることに注意して下さい。したがって、細胞を蛍光灯にさらされている時間の量を最小限に抑える。 </li></ol></li><li> Steinbergの飼育のソリューションを使ってコンテナにオタマジャクシを返します。 </li></ol>

<ol><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li>
<li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience+%284th+Ed.%29%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
</ol>

単一細胞電気穿孔（SCE）は、遺伝子機能を決定し、標的遺伝子操作を実行するための強力なツールです。アルビノおたまじゃくしの透明性と脳のアクセシビリティは、理想的に生きて生体内で神経細胞の成長と細胞内イベントの可視化のための最適なこのモデルシステムを作る。 SCEは、単一のニューロンの成長の可視化を可能にし、そうでなければ変更されずに脳内で細胞自律的な操作を実行する。このビデオの記事は、アフリカツメガエルのオタマジャクシの単一細胞電気穿孔するための手順を示していますが、この手法は他の生物で使用されており、また、海馬スライスと解離細胞の培養物中で使用されています。

無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

単一細胞電気穿孔（SCE）は、in vivoでの製剤を含む無傷の組織内の個々の細胞へのDNAや他の高分子の配信を可能にする特殊な技術です。この手法の明確な利点は、グローバルな治療から生じるものから、周囲の組織変更されず、それによって特徴的な細胞自律的な効果を残したまま、実験操作が個々のセルで実行される可能性があるということです。 in vivoイメージング技術の高度と組み合わせると、蛍光マーカーのSCEは、細胞形態、細胞増殖、および秒から数日に及ぶ時間スケール上の細胞内イベントの直接可視化を可能にします。この手法は、生体内と生体外での準備での様々な使用されているが、我々はアフリカツメガエルのオタマジャクシで使用するためにこの手法を最適化してきました。このビデオの記事で、我々は詳細アルビノアフリカツメガエルオタマジャクシの無傷の脳内の神経細胞への蛍光色素またはプラスミドDNAのSCEのための手順を。我々はまた、歩留まりを最適化する方法を議論し、蛍光SCEによって標識されたニューロンのライブ二光子蛍光イメージングの例を示します。

単一細胞電気穿孔（SCE）は、in vivoでの製剤を含む無傷の組織内の個々の細胞へのDNAや他の高分子の配信を可能にする特殊な技術です。アフリカツメガエルオタマジャクシの無傷の脳内の神経細胞への蛍光色素またはプラスミドDNAのSCEのためここでは、詳細手順を。

単一細胞電撃法（Single-cell electroporation: SCE）は、無傷の組織内にある個々の細胞にDNAやその他の高分子を導入することを可能にする特殊な技術である。

単一細胞エレクトロポレーションは、組織を維持したまま個々の細胞にDNAやその他の高分子を導入できる特殊な技術であり、高度な生体内イメージング技術と組み合わせることで、in vivoでの調製も可能です。蛍光マーカーを単一細胞エレクトロポレーションすることで、数秒から数日という時間スケールにわたって、細胞形態、細胞増殖、および細胞間イベントを直接可視化できます。本ビデオでは、XUSオタマジャクシの未損壊脳内のニューロンに蛍光染料またはプラスミドDNAを単一細胞エレクトロポレーションする手順を詳しく説明し、蛍光ラベルされたニューロンのライブイメージングの例を示します。こんにちは。私はEth Haaです。ブリティッシュコロンビア大学脳研究センターのKurt Haass博士の研究室に所属しています。本日は、アルビノのXenopus laevisオタマジャクシの生体脳内において、ニューロンを標的とした単一細胞エレクトロポレーションを行う方法を実演します。この手法の明確な利点は、周囲の組織を変化させることなく個々の細胞に対して実験的操作を行えることであり、これにより、細胞自律的な効果と全体的な処置による効果を区別できる点にあります。最初のステップでは、適切な先端径とテーパー角を持つマイクロピペットを作製し、続いてマイクロピペットに移行物質を充填します。次に、TAプールを麻酔して固定チャンバーに移動させ、その後、マイクロピペットを脳内に挿入し、一連の電圧パルスを印加します。最後に、標識されたニューロンを2光子顕微鏡でイメージングします。ここでは、オタマジャクシを用いたこの手法について説明します。単一細胞の標識は、ex vivo調製のみならず、他のモデルシステムにおいても利用可能です。それでは、以上の点を踏まえて始めていきましょう。単一細胞エレクトロポレーションは、引き伸ばしたガラス製マイクロピペット電極を用いて個々の細胞を標的とする手法であり、ピペット先端に接触している単一の細胞にのみ電場を限定させます。ピペット先端の物理的な形状は、この技術の成否に直接影響を与える極めて重要な要素です。ホウケイ酸ガラス（外径1.5 mm、内径0.75 mm）からマイクロピペットを作製するために、ソルダー社製モデルP 97 プラーを使用します。このガラスには、チップへの充填時に気泡が混入するのを防ぐための内部フィラメントが含まれています。単一細胞のエレクトロポレーションに最も効果的であると判明したピペットチップは、先端径が0.5～1 µmで、テーパー角が10度以上のものです。ガラスマイクロピペットの延伸後、バックフィリングまたは充填用シリンジを用いて、溶液中の移行物質をピペット内にロードします。本デモンストレーションでは、ここに示されている蛍光染料、またはGFP（緑色蛍光タンパク質）をコードするプラスミドを用いて、単一ニューロンを蛍光標識します。ピペットに混入する粒子状のデブリを減らすため、GFP溶液は高速で短時間遠心分離してください。不慣れなユーザーの場合、チップが詰まる可能性が高くなるため、エピ蛍光顕微鏡下で容易に視認できる蛍光染料から始めることを推奨します。これにより、サンプル内でのチップの視覚化が可能になり、装置が適切にセットアップされているか、またピペットチップが適切であるかについて直接的なフィードバックを得ることができます。これで準備は完了です。マイクロピペットの準備が整いましたので、単一細胞エレクトロポレーションの手順に進みます。本手法に必要な電気設備は、刺激装置、オシロスコープ、およびピペットに挿入するための銀線が装着されたピペットホルダーです。ここではAxon Instruments社のAx Separator 800 Aを使用していますが、Grass SD9のような一般的な刺激装置でも代用可能です。Ax Separatorはヘッドステージに接続されており、ヘッドステージがAx Separatorと銀線電極の間でインターフェースとして機能します。オタマジャクシ外部接地電極は、オタマジャクシとの電気的接触を維持するための単純な銀線です。エレクトロポレーション中、ヘッドステージ、接地リード、およびオタマジャクシ外部接地電極は、すべてオシロスコープの入力に接続されます。電気機器のセットアップが完了したら、ピペットをピペットホルダーに設置できます。ピペットホルダーは、微細な移動が可能な3軸マイクロマニピュレーターに取り付ける必要があります。単一細胞エレクトロポレーションには、十分な作動距離を持つ顕微鏡が必要です。これにより操作スペースが確保され、ピペットを約30～45度の角度で導入することが可能になります。装置の接続が正しく完了したら、単一細胞へのエレクトロポレーション手順を開始します。まず、オタマジャクシを0.02%MS 2, 2 2に浸して麻酔をかけます。通常、これによりオタマジャクシは完全に麻酔状態になります。約5分後、1匹のオタマジャクシをエレクトロポレーションチャンバーに移します。プラスチック製転送ピペットを用いて、小さなシリコンブロックにオタマジャクシ型の空洞を彫り、チャンバー内にいる際にオタマジャクシの皮膚に接触するように銀の接地線を挿入することで、チャンバーを簡単に自作できます。次に、絵筆を使ってオタマジャクシの位置を調整し、背面が上になるようにします。その後、マイクロピペットを、目的領域に隣接する皮膚に接触するまで下げます。ピペットをさらに下げていくと、最初は皮膚がわずかに窪み、その後、下層の組織へと貫通します。ここでは、タコ脳の視葉をターゲットにしています。具体的には、細胞体層の領域を狙っています。xiを使用している場合は、組織内におけるピペットの抵抗値をモニタリングできます。一般的に、抵抗値は10から約40 MΩであれば良好に動作します。ピペットの抵抗値は、チップの直径が小さすぎないか、あるいはチップが詰まっていないかを確認する優れた指標となります。チップが詰まっている場合は、抵抗値が高くなります。一方で、チップの直径が大きすぎる場合やチップが破損している場合は、ピペットの抵抗値は低くなります。ただし、従来の刺激装置を使用している場合、絶対抵抗値を測定することはできません。オシロスコープの読み取り値は、蛍光デキストラン色素におけるピペット抵抗の間接的な測定値です。刺激は、300 Hzの周波数で印加される10ミリ秒の正方波パルス列で構成されています。個々のパルスの持続時間は300マイクロ秒であり、50 Vの電圧で印加されます。これらの設定を用いることで、電極プローブ後の刺激印加時に、蛍光色素がチップから放出されることが確認できます。その後、ピペットを回収し、得られる量を増やすために組織内の異なる部位でこの工程を繰り返します。電圧パルス列の印加中は、オシロスコープで得られるパルスの振幅をモニターし、必要に応じて振幅を1～1.5 µAの間に調整してください。電圧を大幅に上げた後でもパルス振幅が低いままである場合、または手順の途中で振幅が低下する場合、これはチップが詰まっているか、チップ径が小さすぎることを強く示唆しています。このような状況になると、非常に困難な場合があります。一方で、印加電圧を大幅に下げた後でも振幅が高いままである場合、または手順の途中で振幅が上昇する場合、これはチップが広すぎるか、あるいはチップが破損していることを強く示しています。私はよく感情的になり、悲しくなることがあります。前述の通り、蛍光色素を使用する利点は、提示した刺激パラメータを用いて単一細胞にエレクトロポレーションが行われたかどうかを即座に確認できることです。細胞が非常に暗いか、あるいはラベルされた細胞が見られない場合は、ラベルされた細胞がこのように明るく光るまで、各刺激パラメータを個別に段階的に上げていくことから始めます。きれいにラベルされた細胞が見えると、とても幸せな気持ちになります。一方で、多数の細胞がラベルされているように見える場合は、このように単一の細胞が明るくラベルされるまで、刺激パラメータを徐々に下げて調整します。明るくラベルされた細胞を確認できるのは、非常に達成感があります。プラスミドDNAの場合、使用するパルス列は、持続時間1 ms、周波数300 Hzの負パルスであり、パルス列の持続時間は500 msです。エレクトロポレーション後、TAポールの個体を新鮮な飼育液に移すと、麻酔から速やかに回復します。通常、50から100匹のTAポールにエレクトロポレーションを行った後、次にご説明するスクリーニングに進むことができます。イメージング実験を開始する前に、正立型エピ蛍光顕微鏡を用いてエレクトロポレーションしたオタマジャクシを迅速にスクリーニングすることが有用です。イメージングに適したニューロンを含むオタマジャクシを特定するため、オタマジャクシを麻酔し、シガーチャンバーに配置してカバーガラスで固定します。次に、個々のオタマジャクシの脳をエピ蛍光光下で迅速に観察し、蛍光標識された単一ニューロンが存在するかどうかを確認します。エピ蛍光光への過剰な曝露は、標識細胞を死滅させる光毒性を引き起こすため注意してください。したがって、細胞が蛍光光に曝露される時間は最小限に抑えるようにしてください。デキストラン染料を用いる場合、スクリーニングはエレクトロポレーション後30分から行うことができます。しかし、時間を長く置くことで背景の蛍光レベルが低下することが分かっています。プラスミドの場合、DNAスクリーニングは通常、エレクトロポレーションから少なくとも12時間後に行われます。私たちは、オタマジャクシの視蓋内のニューロンを蛍光標識するために、日常的に単一細胞エレクトロポレーションを用いています。当研究室の2光子顕微鏡はカスタムメイドで、Olympus FV 300共焦点顕微鏡とChameleon XPレーザー光源を用いて構築されています。通常、グリーン蛍光のイメージングには910 nanometersの波長を使用しています。単一の標識されたALニューロンを持つオタマジャクシを見つけ、2光子顕微鏡装置に配置した後、異なる時間間隔で触覚ニューロンのタイムラプス2光子イメージングを行います。これにより、AL細胞の樹状突起の動的な成長パターンを観察することが可能になります。ここでは、単一細胞エレクトロポレーションを用いて標識された、GFP発現ニューロンの例を示します。この画像は、神経細胞の成長を定量化するために生体内（in vivo）二光子顕微鏡を用いて撮影されました。通常、各神経細胞画像のスケルトン化された3次元再構成が作成されます。長い間隔を空けてタイムラプス撮影を行うことで、実験的な操作による長期的な影響を考察することが可能になります。ここでは、樹状突起の分枝が形成されるまでの4日間にわたり、毎日イメージングを行ったGFP発現未熟ニューロンを示しています。これらの画像は2光子顕微鏡を用いて撮影され、Z投影として提示されています。高速タイムラプスイメージングを用いることで、樹状突起フィロポディアの形成と消失を含む、ニューロン成長のよりダイナミックなプロセスの性質を観察することが可能になります。このビデオでは、1時間にわたり2分ごとに3次元撮像を行った、比較的成熟したGFP発現ニューロンを示しています。こちらは、1時間にわたり5分ごとに撮像した未成熟なGFP発現ニューロンの例です。若いニューロンは非常にダイナミックであり、広範な枝の伸展と退縮が見られます。このGFP発現ニューロンの拡大図は、本システムにおける発達中のニューロンに典型的な、樹状突起フィロポディア（糸状仮足）の絶え間ない伸展と退縮を示しています。アルビノオタマジャクシの透明性と脳へのアプローチの容易さにより、このモデルシステムは、生体内でニューロンの成長や細胞内イベントを可視化するのに理想的に適しています。単一細胞エレクトロポレーションを用いることで、単一のニューロンの成長を可視化し、それ以外の部分は改変されていない脳内で細胞自律的な操作を行うことが可能になります。以上で、zap lavis tat polesにおける単一細胞エレクトロポレーションの手法を説明しました。ここではTA polesへのエレクトロポレーションに焦点を当てましたが、この技術は他の生物や、海馬スライス、分散細胞培養においても用いられています。この手順を行う際は、高い収率を維持するために、ピペットチップと刺激パラメータを絶えず調整することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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