シュミット地中海におけるカンジダ・アルビカン感染の最適化プロトコルを、真菌の病因と宿主防御の研究を目的としています

私の研究はカンジダ・アルビカン感染に焦点を当てており、宿主の反応が結果が除去か病気の進行かにどのように影響するかを描いています。大きな課題は、初期の真菌感染に関するモデルが不足していることです。このプロトコルはプラナリアンを扱いやすく高スループットの解決策として用いています。

プラナリア系は、病気の発症、進行、除去、致死率の研究を可能にし、自然免疫応答の高解像度測定を可能にします。まず、体長約5ミリメートルのシュミットテア地中海プラナリアを立体顕微鏡で選び、測定前に動物を完全に伸ばしていることを確認します。5ミリ未満のプラナリアは避けてください。これらは胞球や未完全発育の個体が含まれ、結果に不一致をもたらす可能性があります。

また、5ミリメートルを超えるプラナリスは除外してください。大型の動物は蛍光免疫染色に適さないからです。発芽腫、色素沈着が欠如する組織、または未完全な色素沈着の動物は除外してください。すべての納入基準を満たす健康なプラナリア人を、非組織培養処理済み6ウェルポリスチレンプレートの1井戸あたり2ミリリットルの新鮮なプラナリア水に移す。

感染していないまたは模擬処理された動物からなる陰性対照群と、野生型カンジダ・アルビカンスに感染した動物からなる陽性対照群のウェルを割り当てます。井戸ごとにすべての水を抜き、2ミリリットルの新鮮なプラナリア水に交換して井戸全体の均一さを確保します。感染前に1日間、新しい環境で動物たちを安定させてください。

6ウェルプレートを傾け、無菌技術で1つの井戸からすべての水を優しく抜き取ります。次の井戸に進む前に、計算されたプラナリア水とカンジダ・アルビカンスの培養物の計算量をすぐに井戸に加えます。接種の日時を記録してください。

接種した6ウェルプレートを暗く静的な室温の場所に置きます。目的に応じて最大72時間、カンジダ・アルビカンスでキュベートします。感染から24時間経った最初のタイミングで、プレートを少し傾けてください。

その後、滅菌移送ピペットを用いてカンジダ・アルビカンスを含む液体を吸引し、動物がいないウェルの安全な場所に優しく配布して沈着した真菌層を混合させます。この手順を1井戸に5〜10回繰り返し、定着した菌類層を破壊し、プラナリア人との直接接触を避けます。リスペンディングステップの前後に暗い背景の中で菌類の定着を観察し、最良の視界を確保しましょう。

感染していない制御井戸を同じ条件下で再吊り下げます。感染後48時間後にこの手順を繰り返します。感染後72時間後、プラナリアンを2ミリリットルの清水で新鮮な井戸に移し、最小限の液体で真菌の残留を最小限に抑えます。

動物が移送されたら、すべての水を取り除き、新鮮なプラナリアの水に置き換えます。感染後1日から宿主のアウトカム評価を開始し、目的の実験的エンドポイントまで毎日続けます。標準化された0から3のスコアリングシステムを使って宿主のダメージを定量化する。

感染から3日後、残留菌培養の移送を避けつつ、新しい6ウェルプレートに優しく移し替えます。そこには1井戸あたり2ミリリットルの新鮮なプラナリア水が入っています。動物を光学顕微鏡で観察し、最低でも10倍の大物レンズを使います。標準化されたスコアシートを使ってホストの結果を記録します。

さらに、抗カンジダ免疫染色を用いて、感染および除去中の宿主上皮への真菌定着を観察することができます。真菌上皮の定着は感染後4日で著しく減少し、感染から7日目までにほぼすべての表面関連真菌がID50条件下で除去されました。未感染の対照群は全く無症状のままでした。

約7.0×10の7のカンジダ・アルビカン細胞1ミリリットルあたり、約30%が無症状、50%が症状、20%が死死していました。約8.0×10の7のカンジダ・アルビカン細胞1ミリリットルあたり、約30%が無症状、20%が症状、50%が死死していました。中央値生存率は7.0×10で約90%から、カンジダ・アルビカン細胞7のべき乗/ミリリットルで約50%、8.5×10の7細胞/ミリリットルで約50%、8.5×10の7細胞のべき乗で25%未満に低下しました。

野生型カンジダ・アルビカンスに感染したプラナリアの総生存率は約50%で、約8.0×10の7細胞毎ミリリットルの乗数で、未感染対照群では100%生存率と比べて高かった。このプロトコルは、遺伝的に扱いやすい宿主における画像診断と分子解析を統合することで、宿主-病原体の動態をin vivoで研究することを可能にします。将来の応用には、高スループット変異体スクリーニング、微生物種間の比較研究、毒性学および薬剤有効性試験への適応が含まれます。