Name: 酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学ぼう、マウスsoleus筋からの単一線維分離法。コラゲナーゼ濃度と消化時間を最適化し、300～500本の高収率・高生存率な線維を取得。免疫染色や衛星細胞培養に応用可能な神経筋疾患研究の基盤技術です。

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<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18%E2%80%9388+yr%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeletal+muscle+satellite+cell%3A+The+stem+cell+that+came+in+from+the+cold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold.</a> J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).</li>
<li>Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+and+myogenic+progression+in+skeletal+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells.</a> J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Günther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+characterisation+of+the+molecular+signature+of+quiescent+and+activated+mouse+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5205(2009).</li>
<li>Halevy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+Pax7+expression+during+myogenesis+in+the+posthatch+chicken+establishes+a+model+for+satellite+cell+differentiation+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal.</a> Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).</li>
<li>Biressi, S., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+muscle+satellite+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the muscle satellite cell population.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).</li>
<li>Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+muscle+satellite+cells+are+equal%2C+but+are+some+more+equal+than+others%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others.</a> J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).</li>
<li>Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+reporter+mouse+models%3A+A+pocket+guide+for+satellite+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Transl+Myol%22%5BJournal%5D)">Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research.</a> Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Pette, D., Staron, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms%2C+muscle+fiber+types%2C+and+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions.</a> Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).</li>
<li>Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+polymorphisms+and+fiber-type+composition+of+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+differences+between+actomyosin+ATPase+of+slow+and+fast+mammalian+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle.</a> Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).</li>
<li>Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+scavengers+in+providing+non-material+contributions+to+people%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Indic%22%5BJournal%5D)">Role of scavengers in providing non-material contributions to people.</a> Ecol Indic. 117, 11(2020).</li>
<li>Sullivan, S. M., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+mitochondrial+volume+density+and+capillarity+in+hamster+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles.</a> Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).</li>
<li>Fujita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+lipid+metabolism+and+capillary+density+of+the+skeletal+muscle+following+low-intensity+exercise+training+in+a+rat+model+of+obesity+with+hyperinsulinemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia.</a> PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).</li>
<li>Narusawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+myosin+in+developing+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Slow myosin in developing rat skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).</li>
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<li>Denardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2x-myosin+heavy+chain+is+coded+by+a+muscle+fiber+type-specific+and+developmentally+regulated+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene.</a> J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).</li>
<li>Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+type+and+fiber+type+specificity+in+muscle+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).</li>
<li>Talbot, J., Maves, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+type%3A+Using+insights+from+muscle+developmental+biology+to+dissect+targets+for+susceptibility+and+resistance+to+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).</li>
<li>Celegato, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+protein+and+transcript+profiles+of+FSHD+patient+muscles+correlate+to+the+D4Z4+arrangement+and+reveal+a+common+impairment+of+slow+to+fast+fibre+differentiation+and+a+general+deregulation+of+MyoD-dependent+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes.</a> Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).</li>
<li>Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+and+identifying+satellite+cell-opathies+within+muscular+dystrophies+and+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies.</a> Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).</li>
<li>Gallagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+84-days+of+bedrest+and+resistance+training+on+single+muscle+fibre+myosin+heavy+chain+distribution+in+human+vastus+lateralis+and+soleus+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles.</a> Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).</li>
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<li>Shenkman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+slow+to+fast%3A+Hypogravity-induced+remodeling+of+muscle+fiber+myosin+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype.</a> Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).</li>
<li>Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+skeletal+muscles+to+gravitational+unloading+and%2For+reloading%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading.</a> J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).</li>
<li>Higashino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+in+muscle+atrophy+and+muscle+fiber+type+conversion+after+spinal+cord+transection+and+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroeng+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats.</a> J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).</li>
<li>Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+muscle+fibers+are+preferentially+affected+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy.</a> Cell. 52 (4), 503-513 (1988).</li>
<li>Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+decrease+of+IIx+myosin+heavy+chain+transcripts+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy.</a> Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).</li>
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<li>Kotelnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+to+meta-analysis+of+microarray+datasets+reveals+muscle+remodeling-related+drug+targets+and+biomarkers+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy.</a> PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).</li>
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<li>Lassche, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomeric+dysfunction+contributes+to+muscle+weakness+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).</li>
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<li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li>
<li>Collins, C. A., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+grafting+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and grafting of single muscle fibres.</a> Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).</li>
<li>Ravenscroft, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+flexor+digitorum+brevis+myofiber+culture+system%E2%80%94a+more+mature+muscle+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).</li>
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<li>Moyle, L. A., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+immunostaining+of+skeletal+muscle+fibres+to+study+myogenic+progression+in+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells.</a> Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).</li>
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<li>Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+single+myofibers+from+Mus+musculus%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus.</a> Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol tartrate</td><td>Meiji Yakuka Co., Ltd</td><td>711-12</td><td>製品名：Vetorphale注射</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>US Biological</td><td>C3999</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type I</td><td>Worthington</td><td>M9B2717</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-free DMEM</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569</td><td></td></tr><tr><td>High-glucose DMEM+GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Life technology</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Low-protein binding filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride</td><td>Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd</td><td>8816</td><td>製品名：Dorbene注射</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>4987211762100</td><td>製品名：Dormicum注射</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspension</td><td>Wako</td><td>161-23181</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S stain solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24-3875-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (25 mL)</td><td>IWAKI</td><td>2362-025</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>IWAKI</td><td>5 3/4 IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin dishes (100-mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020-100</td><td>原稿ではペトリ皿として参照</td></tr><tr><td>Anbitodies for immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-32723</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Myosin Heavy Chain</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB4470</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>AB-528428</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-MyoD</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-760</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anbitodies for immunoblotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated Anti-mouse IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA931</td><td>1:1000/馬蹄鉄ペルオキシダーゼ</td></tr><tr><td>HRP-conjugated Anti-Rabbit IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA934</td><td>1:1000/馬蹄鉄ペルオキシダーゼ</td></tr><tr><td>Mouse Anti-MyHC I</td><td>Sigma</td><td>M8421</td><td>1:1000/ Myosin Heavy Chain I</td></tr><tr><td>Mouse Anti-MyHC II</td><td>Sigma</td><td>M4276</td><td>1:1000/ Myosin Heavy Chain II</td></tr><tr><td>Mouse Anti-PGC-1&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-517380</td><td>1:1000/ Pparg coactivator 1 alpha</td></tr><tr><td>Mouse Anti-&alpha;-tubulin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3873</td><td>1:1000/ Alpha tubulin</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-COXIV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#4850</td><td>1:1000/ Cytochrome c oxidase IV</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2218</td><td>1:10000/ Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GLUT4</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2213</td><td>1:1000/ Glucose Transporter 4</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-&beta;-actin</td><td>Proteintech</td><td>20536-1-AP</td><td>1:2000/ Nonmuscle Beta-actin</td></tr></tbody></table>

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

Single Fiber Isolation Assay for the Assessment of Oxidative Myofiber Behavior

本技術により、単離された線維(SOL)および長伸筋(EDL)の線維がPax7に対して効率的に免疫標識できることが示されています(図3B)。これらの分離された繊維は、DMEM + GlutaMAXと10%ホースセラム、1% AB、0.5% CEEからなる浮遊培養培地に3日間保管し、その後免疫標識を施します(図3B)。浮遊繊維を4日以上保持するのは推奨されません。上記の浮遊繊維条件下では、筋繊維はこの時間後に凝集しやすく、その後の免疫標識解析に影響が及ぶ。
提示された技術は、筋原プログラム全体にわたる免疫ブロッティングにもさらに用いられます(図3C)。実際、SOLおよびEDL由来の筋芽細胞は約70%の合流率で24ウェルプレートにプレートされていました。細胞は培養培地で1日間維持された(筋芽細胞)、または2日間または4日間分化を誘導された(それぞれ早期形成および分化した筋管)。免疫ブロッティング解析のために5μgのタンパク質をロードしました。
MyHC Iの発現はほぼ特異的にSOL由来の筋繊維で発現し、筋管内での発現は最小限で、筋芽細胞では無視できるほどでした(図3C)。MyHC IIはSOLおよびEDL筋線維の両方で発現しました。この式は主にタイプIとIIaからなるSOLを反映し、EDLは主にIIxおよびIIbの線維で構成されています。MyoblastsはMyHC IIを発現しませんでしたが、分化過程でその発現が徐々に増加しました。酸化関連タンパク質であるPGC-1αとCOXIVは、SOL由来繊維での期待される高い発現を示しました。また、単離SOL線維ではEDL線維よりもGLUT4の発現が高いことが検出されました。骨格筋生物学者が直面する可能性のある問題は、α-チューブリン、βアクチン、GAPDH、ポンソーSを含む全タンパク質染色などの広く使われているハウスキーピングタンパク質や負荷制御が、筋芽細胞、筋管、孤立筋繊維間で安定しず、それぞれに明確な変動を示すことです。α-チューブリンおよびβ-アクチンの信号強度はマイオチューブで最も高く、ポンソーS染色は筋芽細胞で比較的弱かった。対照的に、GAPDHはEDL筋繊維でより強い発現を示しました。それでも、実験目的によっては、これらのハウスキーピングタンパク質のうちの1つが依然として適用可能であり、熱ショックタンパク質70(HSP70)などの正規化因子も検討可能です。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig1.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 1"> 
図1。ヒメ筋の解離。(A) 解剖に必要な機器。1:マイクロハサミ、2:細い鉗子、3:解剖用のハサミ、4:解剖ピン。(B)PLA腱はGASおよびSOL腱束から切断されました(黄色の矢印)。遠位のPLA(白い矢印)腱は鉗子で持ち上げられました。(C) SOL(赤い矢印)とGAS(緑の矢印)の近位腱の間の空間に解離ピンを挿入した。(D) SOLが解剖ピンでGASから分離された。(E) GAS側でGASおよびSOL腱束を切断した。(F)その後、SOL近位腱をマイクロハサミで切断しました。(G)追加の遠位腱束も除去されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 2"> 
図2。ヒメ筋線維の単離。(A) 隔離に必要な機器。1:狭口径、2:広口径パスツールピペット。(B) 分離に用いられる立体顕微鏡。(C) コラゲン酵素で消化されたヒヤメウスを1%ABでDMEMに移管した。(D) 最初の10回の洗浄セッション後に筋肉から分離したヒヤメ筋線維。(E) 単一繊維が第2皿に移される。(F) 破片や縮んだ繊維がきれいに除去された画像。(G)ゴミのない単線繊維が3番目の皿に移されました。(H)無傷の単線繊維がはっきりと見える。スケールバー=10mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 3"> 
図3。細胞培養の拡大およびEDLおよびSOL由来サンプルの解析。(A) 分離後6日後、増殖培地培養サンプルは、分離されたイモリウス繊維から得られた純粋な筋芽細胞培養を示します。スケールバー=100μm(B)SOLおよびEDL由来の単一線維は、分離直後または3日後にPax7(緑色)に免疫標識されたサテライト細胞を示しています。MyoD(赤)の不在は、衛星細胞がまだ筋生成活性化にコミットしていないことを裏付けています。繊維はDAPI(青)でカウンターステインされました。その後、細胞は蛍光顕微鏡で観察されました。スケールバー=20μm(C)では、マイオブラスト、マイオチューブ、マイオファイバー由来サンプルの免疫ブロットに5μgのタンパク質が使用されました。免疫ブロッティングパネルでは、MyHC I、MyHC II、PGC-1α、COX IV、GLUT4、α-チューブリン、βアクチン、GAPDHがハウスキーピング/正規化標的として用いられました。ポンソーS染色は総タンパク質ローディング制御に使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>

Skeletal muscle is composed of multinucleated myofibers whose integrity and function are essential for movement and overall health. In neuromuscular ...

single-fiber-isolation-assay-for-assessment-oxidative-myofiber

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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サポニン透過性心臓繊維の呼吸計測の酸化的リン酸化の評価

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酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

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