間接磁気ビーズ戦略を用いたポドプラニン陽性間葉質幹細胞サブポピュレーションの単離と検証

私たちの研究は、高純度かつ可読性の高いコスト効率の高い磁気ビーズ軟化のために、特定の間葉系幹細胞サブセットを単離することに焦点を当てました。このプロトコルは標準的なPE共役抗体を用いて、あらゆる膜タンパク質に適用可能です。まずは必要な試薬を集めましょう。

80%から90%の合流度に達した3番から5番のパッセージから間葉幹細胞(MSC)を選択します。培養媒体は捨てましょう。細胞を10ミリリットルの予温されたPBSで2回洗います。

容器を優しく揺らし、PBSを捨てます。0.25%トリプシン-EDTAを2ミリリットル加え、37度で3〜5分間培養します。顕微鏡で細胞が丸まり、剥離が始まるまで観察します。

トリプシンを中和するために、16.5%FBSを含む培地を4ミリリットル加えます。細胞を完全に剥離させるために優しくピペットで除去し、細胞懸濁液を15ミリリットの遠心分離機管に移します。細胞懸濁液を300gで遠心分離し、上澄液を廃棄します。

細胞ペレットを1ミリリットルのバッファーに再懸浮させます。セル数を数えて合計セル数を決めます。先ほど示した通り、遠心分離機で上清液を廃棄します。

バッファーで細胞を再懸浮させ、密度を1ミリリットルあたり1億個にします。セル懸濁液を5ミリリットルのポリスチレン丸底管に移します。1000万細胞あたり10マイクロリットルのFcガンマRIIブロッカーを追加してください。

優しく混ぜて室温で10分間孵化させます。1,000万細胞あたり5マイクロリットルのフィコエリスリン結合抗体(PE結合抗体、抗ヒトポドプラニン、PDPN抗体)を追加します。優しく混ぜて、室温で15〜20分間、光を遮って孵育します。

1000万細胞あたり10マイクロリットルのセレクションカクテルを加えます。優しく混ぜて室温で15分間孵育します。ボルテックスミキサーを使って磁気ビーズのバイアルを30秒間激しく混混させます。

1,000万細胞あたり5マイクロリットルの磁気ビーズを加えます。優しく混ぜて室温で10分間孵化させます。標識付きセルサンプルを含む5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブを磁気分離スタンドに入れます。

チューブにバッファーを加えて、合計容量を2.5〜3ミリリットルにします。そして室温で5分間孵化します。磁石とチューブを一体化させて一体化し、逆さまにして上澄液を新しい集水管に注ぎます。

収集したPDPN陰性細胞分画を氷に保管します。前述の磁気分離手順を3回繰り返し、分離ごとに上清液を同じPDPN陰性分画集管に注ぎます。最終洗浄後、磁気分離スタンドから磁気結合されたPDPN正セル分画を含むチューブを取り出します。

陽性細胞を再懸浮させるためにバッファーを3ミリリットル追加します。陽性分画細胞懸濁液を新たに標識したチューブに移します。陽性・陰性の分割管の両方の細胞数を数えます。

各分画の細胞収率を記録します。正分率セル懸濁液を300gで3分間遠心分離し、上清液を廃棄します。細胞ペレットを16.5%FBSを含むMEMアルファ培養培地に再懸浮させます。

必要に応じて細胞密度を調整し、培養皿やフラスコに細胞を植え付けます。細胞は37度Cで5%二酸化炭素のインキュベーターで培養します。細胞数を数えた後、12ミリリットルの培地で100ミリメートルの培養皿に300万細胞の密度で種子をまきます。

種まきから24時間後、細胞の付着を観察してください。培養培地を新しい培地に置き換えて、残留磁性ビーズや非接着細胞を除去します。トリプシン化によって細胞を収穫する。

細胞懸濁液を10〜15回上下に優しくピペットで動かし、磁気ビーズや残留抗体を外して除去します。フローサイトメトリーでPDPNPE陽性細胞の割合を評価します。対数成長期に細胞を集めます。

細胞を96ウェルプレートにシーディングします。異なるタイミングで、セルカウンティングキット-8mまたはCCK-8を追加し、試薬を施し、メーカーの指示に従って吸収を測定してください。GraphPad Prismソフトウェアで異なる時間点の事前ソートおよびソート後データを集計し、データをクリックして増殖曲線をプロットします。

FC受容体遮断、抗体標識、磁気分離の結果、最終的な細胞数はPDPN陽性部分で約350万細胞、陰性細胞が約640万個でした。磁気選別前は、開始細胞集団におけるPDPN陽性細胞の頻度は38.7%でした。選別後、陽性割画には97.9%のPDPN陽性細胞が含まれていました。陰性部分のフローサイトメトリー解析では、PDPN陽性細胞の4.30%が残っており、陰性部分からPDPN陽性細胞が効率的に枯渇していることが示されました。

PDPN陽性細胞の3日間連続培養における増殖曲線は未分類MSCと比較して有意な差がなく、未分類MSCと比較してCCK-8ベースの増殖や代謝活動の検出可能な減少を示さなかったことを示している。このアプローチにより、高い純度と可読性を持つ亜集団の研究が可能になります。このプロトコルで最も重要な考慮点は、細胞の可読性を優しく保ち、結合していないビーズを除去することです。

この手順に従い、増殖アッセイや堆積・デフレーション研究を研究で行うことが可能です。