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本研究は、広東省基礎・応用基礎研究財団（2023A1515011278）、広東省生物技術研究院自費プロジェクト（GDBRI-ZL202602）、および心血管疾患モデルと病因に関する中加学術交流・協力（MS202500058）の支援を受けて行われました。

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. 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M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

本研究では、CRISPR/Cas9を用いてCracd欠損マウスを作製し、心筋梗塞（MI）後の表現型解析を行うために、従来の心エコー検査、スペックル追跡ストレインイメージング、および組織学的解析からなるワークフローを構築しました。このプロトコルにより、CRACDタンパク質の消失が確認されたノックアウトマウスを作製しました。Cracd欠損マウスは、MI後に野生型（WT）コントロールと比較して、心室拡張の抑制、EFの改善、および線維化の減少を示し、心リモデリングの研究における本モデルの有用性が確認されました。
このモデルの成功は、いくつかの重要なステップに依存しています。gRNAの設計およびインビトロでの検証は、受精卵編集の効率に直接的に影響します。23CRISPickまたはBenchlingを用いてCRISPRaterスコアが0.5以上のgRNAを選定し、その後、in vitro Cas9/gRNAアッセイで切断効率を検証します。以下のgRNAのみを &#62; 50%の切片をマイクロインジェクションします。また、左前下行枝（LAD）の適切な結紮も同様に極めて重要です。右心室への穿刺（深すぎる場合）や血管の閉塞不全（浅すぎる場合）を避けるため、7-0縫合糸をLAD起始部から2〜3 mm離れた、深さ0.5〜1 mmの位置に通す必要があります。前壁が即座に白くなることで閉塞が確認されます。さらに、心エコー検査中の心拍数制御も不可欠です。24イソフルラン（通常1～2%）を調整して450～550 bpmに維持することで、従来の測定および歪み（ストレイン）測定の再現性が向上します。最後に、スペックルトラッキング解析においては、カラーコード化されたメッシュの視覚的評価が不可欠です。25メッシュは、急激な変動なく心筋の境界に沿っている必要があります。そうでない場合は手動での修正が必要です。3回試行しても品質が低いままである場合、そのマウスは除外されます。
プロトコルを厳密に遵守しても、特定の技術的な問題が発生することがあります。体系的なトラブルシューティングによって、そのほとんどを解決できます。生殖細胞系列への伝達率が低い（10%未満）場合は、通常、ドナーオリゴヌクレオチドの組み込み効率が低いか、gRNA活性が弱いことを示しています26。したがって、ドナーオリゴの濃度を20 ng/µLに上げ、ホモロジーアームを120–200 bpに延長し、gRNAの切断効率（&#62; 50%）を再確認することで、伝達率を向上させることができます。心筋梗塞（MI）後の死亡率が高い（30%超）場合、多くは気胸、出血、または広範囲の梗塞に起因します27。そのため、マウスが覚醒するまで持続的に酸素を投与し、加熱パッドを用いて体温を維持することで、死亡率を著しく低下させられます。結紮後に前壁が蒼白にならない場合は、LADの同定ミスか、縫合が浅すぎる可能性があります。この場合は、LAD（鮮やかな赤色の対角線上の血管）を再確認し、時には解剖顕微鏡を用いて、0.5–1 mmの深さに針を通し直すことで解決します。スペックルトラッキングの品質が低い場合、通常は低フレームレート、境界の不鮮明さ、またはモーションアーチファクトが原因となります28。したがって、フレームレートを上げ、ゲインを微調整し、心内膜トレースを手動で補正し、不整脈のあるサイクルを除外することが有効です。
これらの運用上の考慮事項に加えて、本手法には明確な限界があります。Cracdノックアウトは全身性であるため、すべての組織でCRACDが欠損しています。その結果、全身的な寄与が関与している可能性があるため、観察された保護作用を心筋細胞のみに起因するものと断定することはできません。細胞型特異的な役割を切り分けるには、条件付きノックアウトが必要となります。もう一つの限界は、7日目という単一の時点での評価であることです。これにより、慢性的なリモデリングについては何も分かっていません。したがって、長期的な研究には、より遅い時点（4週または8週）を追加する必要があります。また、再現性は画像品質への依存性という課題があります。すべての超音波診断装置で鮮明な心内膜境界が得られるわけではなく、操作者の習熟度も影響します。そのため、専門的な訓練を受けた者がすべての手術および測定を行うことが推奨されます。
これらの制限を考慮すると、心筋梗塞（MI）後のリモデリングにおける遺伝子機能を研究するための代替戦略と、我々のアプローチを比較することは有用である。AAVを介した遺伝子操作とアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、一般的な2つの代替手段である29,30。AAV9は、交配を行うことなく心臓特異的な一過性の過剰発現またはノックダウンを導入できるが、パッケージング容量の制限（約4.7 kb）、導入効率のばらつき、およびオフターゲット効果が欠点となる31。対照的に、本研究のCRISPR/Cas9ノックアウトモデルは、永続的かつ完全な機能喪失を可能にし、長期的な研究において有利である。ASOは、迅速に発現し、用量依存的な可逆的ノックダウンを提供するため、急性期の介入に適しているが、繰り返しの投与が必要であり、組織特異性に欠ける32。したがって、本稿で述べる構成的ノックアウトは、初期の発見および慢性期の表現型解析に最適である。
最終的に、本プロトコルはCRACD以外にも幅広く応用可能です。CRISPR/Cas9によるノックアウトマウスの作製に、心エコー検査、ストレインイメージング、および組織学的解析を組み合わせた同一のワークフローを用いることで、心筋梗塞（MI）後のリモデリングにおけるあらゆる候補遺伝子の評価が行えます。この表現型解析の枠組みは、横大動脈狭窄（圧力負荷）や虚血再灌流傷害などの他の心血管疾患モデルにも適合します。さらに、本プロトコルで得られた組織サンプルは、分子メカニズムを解明するためのマルチオミクス解析（トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス）に使用できます。Cracd欠損モデルは薬剤試験のツールとしても活用でき、CRACD経路を介して作用すると考えられる化合物を評価することが可能です。したがって、本プロトコルは、心血管研究における幅広いメカニズム研究およびトランスレーショナル研究に適応可能なプラットフォームを提供します。

心筋梗塞（MI）は、世界的に見て罹患率および死亡率の主要な原因となっており、世界の心血管健康に大きな負担を与えています1。MI後の長期予後は、主に左室（LV）リモデリングのプロセスによって決定されます2。これには心室の拡大、壁の菲薄化、および間質性線維化が含まれ3,4、これらが心不全（HF）への進行における主要な要因となります。MI後の心リモデリングに起因するHFの世界的な発生率は、心血管疾患の負担をさらに悪化させています5。これらの確立された臨床的観察にもかかわらず、感度が高く再現性のあるin vivoモデルを用いて、MI後のリモデリングにおける特定遺伝子の役割を評価する系統的な研究は不足しています。現在、CRACDのような細胞骨格調節因子を評価するために、CRISPR/Cas9で構築されたノックアウトモデルと高度なストレインイメージングを組み合わせたプロトコルは存在しません。したがって、精密な遺伝子操作と高解像度の心機能表現型解析を可能にする手法が急務となっています。
Capping protein inhibiting regulator of actin dynamics (CRACD)（別名KIAA1211）は、主に細胞質に局在するアクチン重合の調節因子であり、細胞骨格のダイナミクスにおいて重要な役割を果たしている6。CRACDは、アクチンキャッピングタンパク質（CAPZA1、CAPZA2、CAPZB）に結合し、それらがアクチンフィラメントのバーブド端をキャッピングすることを妨げることで、アクチン重合を正に制御する7。上皮組織において、CRACDはアクチン細胞骨格の完全性を維持することで、細胞形態の維持および信号伝達において重要な役割を担っている8,9。腫瘍細胞では、その調節不全が細胞の転移および増殖の亢進に関連している6,10。心臓におけるCRACDの役割は完全には解明されていない。心臓のトランスクリプトーム解析および実験的介入研究により、Cracd遺伝子の発現は病理学的ストレスに応答し、心室リモデリング中の細胞骨格ダイナミクスに関連する遺伝子を調節している可能性が示されている9,11。さらに、その抑制タンパク質であるCapZは心疾患と密接に関連しており、CapZのリン酸化はフェニレフリン誘発性の肥大における筋原線維の成長を調節する12。我々の初期研究では、CRACDの緩やかなダウンレギュレーションが心筋損傷に対する保護効果をもたらし、急性虚血後の筋フィラメント収縮能を維持することが示唆されている13。これらの知見は、心筋梗塞（MI）後の不適応的な心室リモデリングにおいてCRACDが役割を果たしている可能性を提起している。しかしながら、虚血ストレス下でのCracd欠損マウスの作製および表現型解析に関する検証済みのステップバイステップのプロトコルが欠如していたため、Cracd欠損がMI後のリモデリングを調節するかどうかを検証する体系的なin vivo機能喪失研究は行われていなかった。
構成的ノックアウトマウスを作製する方法はいくつか存在する。胚性幹細胞（ES細胞）を用いた伝統的な相同組換えは精密であるが、コストが高く、時間がかかり（12〜18ヶ月）、また特定のマウス系統に限定される14。ENU（N-エチル-N-ニトロソ尿素）変異導入法はランダムな点変異を誘導するため、広範なバッククロスとシーケンシングが必要となる15。対照的に、CRISPR/Cas9は本研究において明確な実用的利点を持つ。(i) 接合子への直接注入により、期間を4〜6ヶ月に短縮できる。(ii) 大きなゲノム断片（3153 bp）を欠失させることができ、完全な機能喪失を確実にできる。(iii) 系統変換を行うことなく、C57BL/6Nバックグラウンドで直接的に作用する。(iv) 選抜マーカーを回避でき、意図しない転写干渉を最小限に抑えられる。したがって、日常的な心血管表現型解析に適したCracd欠損ラインを作製するには、CRISPR/Cas9が最も効率的な選択肢である。この技術は、精密なin vivoでの機能喪失研究を遂行するために広く利用されてきた16,17。
スペックルトラッキング心筋ストレインイメージングは、心筋内の自然な音響スペックルの動きをフレームごとに追跡する後処理手法であり、これによりストレイン（長さの分率変化）やストレインレート（変形速度）などの心筋変形パラメータを算出することが可能です18。全般的機能指標（駆出率、短縮率、左室内部径）を提供し、局所的な壁運動異常に対しては比較的感度が低い従来のMモードや二次元心エコー検査とは異なり、ストレインイメージングでは分節的な収縮機能を定量化できます。これは、特に心筋梗塞後の早期において重要であり、重大な局所機能不全があるにもかかわらず、非梗塞部位の代償性過剰収縮によって全般的な駆出率が維持される場合があるためです。スペックルトラッキングは、標準的なエンドポイントと比較していくつかの利点があります。まず、分節的なストレイン、ストレインレート、変位、および速度を算出できるため、微細な亜臨床的変化を検出できます19。また、不可逆的なリモデリングが起こる前に、同期不全や早期の収縮不全を特定できます。さらに、虚血に最も脆弱な層である心内膜下を直接的に評価できます20。本研究において、CRACDは微視的なレベルで心筋細胞の収縮性に影響を与える可能性のある細胞骨格調節因子です。従来の心腔ベースの測定では、このような局所的な機械的影響を見落とす可能性があります。したがって、本プロトコルにスペックルトラッキング解析を組み込むことで、Cracd欠損による早期の保護効果を検出する能力を高めることができます。以上のことから、本プロトコルにスペックルトラッキングを統合することは、心筋梗塞後のリモデリング、特に早期の拡大と収縮不全が出現する心筋梗塞後1週目の評価において、感度の高い定量的なツールを提供することになります21,22。
本プロトコルは、構成的ノックアウトと高解像度イメージングを組み合わせ、心筋梗塞（MI）後急性期（7日目）のリモデリングに対する特定遺伝子欠損の機能的影響を調査する研究者向けに設計されています。本手法は、標的遺伝子の全身的な喪失が許容され、主要エンドポイントが早期の収縮機能および構造的変化である、仮説生成研究に適しています。ただし、いくつかの制限を考慮する必要があります。第一に、Cracd欠損マウスは全身性ノックアウトであるため、観察された心保護効果を心筋細胞におけるCRACDの喪失のみに帰属させることはできず、全身的な寄与が関与している可能性があります。心臓特異的な欠損を実現するには、条件付きノックアウト戦略を用いた今後の研究が必要です。第二に、本プロトコルは単一の時点（7日目）に焦点を当てており、慢性的なリモデリングや心不全（HF）の進行については扱っていません。急性期以降の縦断的研究が必要となります。第三に、スペックルトラッキング解析には高品質な画像（明瞭な心内膜境界）と専用ソフトウェアが必要であり、すべてのコアファシリティで利用可能とは限りません。これらの制限はあるものの、本プロトコルは、MI後の心リモデリングに関与する遺伝子の初期機能特性を評価するための、堅牢で再現性の高いプラットフォームを提供します。
本研究は、CRISPR/Cas9システムを利用して、～を生成および検証することを目的とした。 クラックド欠損マウスモデル（C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 から c.3352+255 欠失)）〜の影響を調査するための Cracd 心筋梗塞（MI）後の心リモデリングおよび心室壁運動における欠損。野生型（WT, C57BL/6N）および Cracd欠損マウスを用い、心筋梗塞（MI）の1週間後に包括的な評価を行った。評価項目には、従来の心エコー図パラメータ、スペックルトラッキング心筋ストレイン解析、および組織病理学的評価が含まれた。特に、初期のリモデリング事象を捉え、〜かどうかを判定するため、MI後の早期段階（7日目）に焦点を当てた。 Cracd 欠損は、心筋梗塞（MI）の急性期における心室拡大および収縮機能に影響を及ぼします。これらの知見は、MI後の悪性心室リモデリングの調節におけるCRACDの役割について、有用な洞察を提供することが期待されます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリスマ塩酸塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>DNA抽出バッファーの調製に使用</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>マウス尾部の消化に使用</td></tr><tr><td>Green Taq Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>P131</td><td>PCR増幅に使用</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>BioFroxx, Germany</td><td>1110GR500</td><td>1&amp;ndash;2%濃度のDNAゲル電気泳動に使用</td></tr><tr><td>DNAマーカー</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>PCR産物のサイズ決定用DNAラダーとして使用</td></tr><tr><td>TIANamp Genomic DNA Kit</td><td>Tiangen Biotech, China</td><td>DP304</td><td>マウス尾部組織からのゲノムDNA抽出に使用</td></tr><tr><td>MEGAshortscript&amp;trade; T7転写キット</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>gRNAのインビトロ転写に使用</td></tr><tr><td>RNA精製キット</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>転写されたgRNAの精製に使用</td></tr><tr><td>BeyoCRISPR&amp;trade; sgRNAスクリーニングキット</td><td>Beyotime, China</td><td>D8412S</td><td>gRNA切断活性のインビトロ評価に使用</td></tr><tr><td>RNaseインヒビター</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>インビトロ転写中のRNA分解防止に使用</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>R001A</td><td>マウス尾部DNAのPCRジェノタイピングに使用</td></tr><tr><td>FERTIUP&amp;reg; マウス精子前培養培地: PM</td><td>Cosmo Bio, Japan</td><td>KYD-002-EX</td><td>体外受精前の精子キャパシテーションに使用</td></tr><tr><td>T7 ARCA mRNAキット</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Cas9 mRNAのインビトロ転写に使用</td></tr><tr><td>妊娠馬血清性ゴナドトロピン</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>超排卵に使用。腹腔内投与</td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>ProSpec, Israel</td><td>HOR-250</td><td>排卵誘導に使用。腹腔内投与</td></tr><tr><td>RNaseフリー水</td><td>Aladdin, China</td><td>R665526</td><td>RNAの溶解およびPCRセットアップに使用</td></tr><tr><td>プライマー</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>/</td><td>ジェノタイピングに使用</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手術&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>RWD Life Science, China</td><td>R510-22-10</td><td>手術中の麻酔導入および維持に使用</td></tr><tr><td>除毛クリーム</td><td>Veet, France</td><td>1000207</td><td>手術および超音波検査前に胸部の被毛を除去するために塗布</td></tr><tr><td>7-0 縫合糸</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ7022380206</td><td>左前下降（LAD）冠動脈の永久結紮に使用</td></tr><tr><td>4-0 縫合糸</td><td>Lingqiao, China</td><td>LQ4022380412</td><td>手術後の皮膚切開部の閉鎖に使用</td></tr><tr><td>麻酔用ベンチレーター</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>イソフルランの投与および呼吸維持に使用</td></tr><tr><td>小動物用ベンチレーター</td><td>Taimeng, China</td><td>HX-101E</td><td>開胸手術中の陽圧換気に使用</td></tr><tr><td>恒温加熱パッド</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>手術中および回復中のマウス体温維持に使用</td></tr><tr><td>肋骨開展器</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>LN-18-4101</td><td>肋骨を分離し、LAD結紮のために心臓を露出させるために使用</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-0551</td><td>皮膚切開および組織切断に使用</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ 745</td><td>LAD冠動脈結紮手術中に拡大視野を提供するために使用</td></tr><tr><td>微細針保持器</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, China</td><td>18-2211</td><td>顕微鏡下で小型の7-0縫合針を操作するために使用</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学薬品および試薬&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波カップリング剤</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, China</td><td>TM-100</td><td>心エコー検査時に胸部に塗布し、プローブの適切な接触を確保</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>摘出後の心臓組織の固定に使用</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Macklin, China</td><td>1330-20-7</td><td>染色の前のパラフィン除去および組織透明化に使用</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>核染色。HE染色に使用</td></tr><tr><td>エオシン</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>細胞質染色。HE染色に使用</td></tr><tr><td>ポンソーS</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>マッソン染色における細胞質染色に使用</td></tr><tr><td>ホスホモリブデン酸</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>マッソン染色における媒染および分化に使用</td></tr><tr><td>アニリンブルー溶液</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>マッソン染色におけるコラーゲン繊維（青）の染色に使用</td></tr><tr><td>CRACD抗体</td><td>Absea, China</td><td>KC-35356</td><td>ウェスタンブロットによるCRACDタンパク質検出用の一次抗体、希釈倍率 1:2000</td></tr><tr><td>GAPDH抗体</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>ウェスタンブロット用のローディングコントロール抗体、希釈倍率 1:5000</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Macklin, China</td><td>64-17-5</td><td>脱水および試薬調製に使用（70%、80%、95%、100%グレード）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;実験機器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17遠心機</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>日常的なサンプル調製に使用</td></tr><tr><td>PCRサーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>DNA増幅に使用</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシステム</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5193000020</td><td>接合子へのCRISPR/Cas9試薬のマイクロインジェクションに使用</td></tr><tr><td>Vevo 2100 イメージングシステム</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>Vevo2100</td><td>心筋梗塞（MI）後の心機能および構造を非侵襲的に評価するための高周波イメージングシステム</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Leica, Germany</td><td>DM2500</td><td>HE染色およびマッソン染色を施した心臓切片の観察に使用</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;解析ソフトウェア&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>面積測定、シグナル定量化、組織学的画像（HEおよびマッソン染色）の処理を含む画像解析に使用</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>/</td><td>心機能解析用VevoLabソフトウェア。VevoStrainモジュールは、MI後の心機能を評価するための心筋ストレイン解析に使用</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>統計解析およびグラフ作成に使用</td></tr></tbody></table>

心筋梗塞後のリモデリング研究のためのcrispr/cas9編集によるcracd欠損マウスモデルの作製および表現型解析

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

このプロトコルでは、C57BL/6N-の作製および表現型解析について説明します。Cracdem1(c.538-83からc.3352+255欠損) 心筋梗塞後の心室再構築におけるCRACDの役割を研究するための、CRISPR/Cas9技術を用いたマウスモデル。

心筋梗塞後のリモデリング研究のためのCRISPR/Cas9編集によるCracd欠損マウスモデルの作製および表現型解析

心筋梗塞（MI）は、世界的に見て依然として罹患率および死亡率の主要な原因となっています。本プロトコルでは、…を生成および特性解析するための手法について解説します。

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

我々は、再現性を高めるために左前下行枝（LAD）に結紮の位置決めにおいてより明確にするために可能にするマウスモデルにおける心筋梗塞（MI）をシミュレートするための実験的虚血/再灌流（I / R）傷害を誘導するための外科的方法を紹介マウスでのMIの実験の。...

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

心不全は入院の主な原因であり、主要な死亡原因です。マウスにおける左前下行冠動脈の永久結紮のモデルを適用して、心室リモデリングと心筋梗塞後の心機能障害を調査します。マウスにおける侵襲的血行動態測定の技術が提示されます。...

マウスの左前下冠動脈の動脈の常設ライゲーション：心筋梗塞後のリモデリングおよび心不全のモデル

ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR...

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

本明細書では、マウスにおける左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを達成する方法を示す外科的処置について説明する。このモデルは、心筋梗塞の病態生理学とそれに付着した生物学的プロセスを調べるために高い関連性がある。...

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

この記事では、マウスの心筋凍結傷害後の心臓リモデリングを研究するモデルを示す。...

マウスの心筋梗塞を研究する凍結傷害モデル

このプロトコルは、マウスの心筋梗塞後にmodRNAを使用して、目的の遺伝子を一時的にアップアレートする簡単で一貫した方法を提示する。...

心筋梗塞マウスモデルにおける修飾mRNAの導入

GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価

右心室と左心室の間にはいくつかの違いがあります。しかしながら、右室梗塞(RVI)の病態生理は解明されていない。本プロトコールでは、RVIマウスモデル生成のための再現可能な方法が導入され、RVIのメカニズムを説明する手段を提供し得る。...

マウスにおける右冠動脈の永久結紮による右心室心筋梗塞の生成と特徴付け

このプロトコルは、CRISPR-Cas9技術を使用してゼブラフィッシュ胚の正確なノックイン編集を容易にするアプローチを説明しています。表現型パイプラインは、QT延長症候群関連遺伝子変異をモデル化するためのこれらの技術の適用可能性を実証するために提示される。...

CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。...

Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

心筋梗塞後のリモデリング研究のためのCRISPR/Cas9編集によるCracd欠損マウスモデルの作製および表現型解析

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