ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

ミトコンドリアは、代謝やエネルギー生産から細胞死のプログラム、ステロイドホルモン合成まで、細胞生理学において多くの役割を果たしています。ミトコンドリアは、基本的な細胞機能と疾患の両方において重要であるにもかかわらず、ヒト胚性幹細胞とその分化した子孫におけるミトコンドリアの機能についてはほとんど知られていません。このビデオでは、ヒトアムリ幹細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体をIngel活性アッセイを使用して分析する方法をご紹介します。

こんにちは、私はカリフォルニア大学ロサンゼルス校の病理学および臨床検査医学科のマイケル・テテル研究室のイヴァンOVです。本日は、ヒト胚性幹細胞におけるミトコンドリア呼吸複合体の機能を評価する手順をご紹介します。これらのゲル活性評価には、この手順には、ヒト胚性幹細胞からの粗ミトコンドリア口蓋の分離、滲出性リン酸化システムのミトコンドリア複合体の分離、高解像度の透明なネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびその後のゲル活性saが含まれます。

それでは始めましょう。この手順の最初のステップは、ヒト胚性幹細胞からミトコンドリアを単離することです。このアッセイでは、フィーダーフリーの状態でマトリゲル被覆プレート上で増殖したヒト胚性幹細胞を使用します。

ヒトアムリ幹細胞からミトコンドリアを採取するためには、まず温かいもの(XPDS pH 7.4)で洗浄し、次に細胞を5分間トリプシンします。6ウェルプレートでウェルあたり1 x トリプシンの1ミルを使用することができます。5分後、1つのXPBSに1ミルあたり1ミリグラムの新鮮なトリプシン阻害剤を等量追加して反応を停止し、細胞を収穫できます。

次に、収集した細胞をGの200倍で室温で5分間遠心分離します。紡糸後、上清を捨てて蘇生し、ペレット化した細胞を0.8〜1.7ミリリットルの氷冷ミトコンドリア分離バッファーに懸濁し、新たに調製したone x protease inhibitorのカクテルを添加します。使用するバッファーの量は、得られる細胞ペレットのサイズによって異なります ペレットが再懸濁された後、氷上で約10分間インキュベートします。

インキュベーション後、ホモジナイザーで細胞をダウンさせると、これには約40〜50回のストロークが必要になる場合があります。ホモジナイズの完全なリストは、DOD細胞のアリコートをトライアンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察することで確認できます。このようになるはずです。

これは、ダウンを伴った50ストローク後の最初のショットです。これはダウンのある80ストローク後のセカンドショットです。細胞が均質化されたら、それらを20,000倍Gで4°Cで10分間遠心分離します。これにより、核とより大きな細胞断片を含む粗いミトコンドリアペレットが得られます。

ペレットを収集する前に、その後のペレットの重量を推定するために収集チューブの重量を量り、上澄みを注ぎ出して廃棄し、次に沈殿した粗ミトコンドリアペレットを秤量する必要があります。この時点でチューブの重量を差し引くことにより、次のステップで示されるペレットの可溶化に進むことができます。粗ミトコンドリアペレットを可溶化するために、まずペレットを氷上に保ち、35マイクロリットルの氷冷可溶化緩衝液でボルテックスします。

ペレット20ミリグラムごとに、緩衝化合物に関する詳細情報が添付の書面によるプロトコルに記載されています。ボルテックスと可溶化バッファーの添加後、digit toinを添加する前に、再懸濁したペレットを高速遠心分離に適したチューブに移し、その後、20ミリグラムのペレット重量に対して10%重量のdigit toinを20マイクロリットル加え、混合した後、チューブをフリックして混合し、ミトコンドリアペレットを氷上で5〜10分間十分にインキュベートします。ドイルβDマルチサイドまたはDDMまたはトリトンX100は、ディジットトインの代わりに可溶化タンパク質にすることができる。

界面活性剤の選択とその量は、氷上でのインキュベーション後の超複合体または多量体型のミトコンドリア複合体の形成に影響を与える可能性があります。そして、ペレットが可溶化されたら、Gの10万倍で4°Cで15分間遠心分離し、透明な上清を回収します。これで、ミトコンドリアのネイティブグラジエントゲル電気泳動用のグラジエントゲル上で動作する上清を準備する準備が整いました。

5〜13%のアクリルアミドグラジエントゲルと3.5%スタッキングゲルの使用をお勧めします。ゲルを調製するために、書面によるプロトコルに記載されているように、アクリルアミドビスアクリルアミドミックスを使用します。アクリルアミドビスアクリルアミド溶液は、事前に調製され、暗所で摂氏4度で保存されます。

アクリルアミドとビスアクリルアミドは、粉末としても液体でも有毒な化学物質であるため、それらを使用するときは特別な注意を払う必要があります。アクリルアミドビスアクリルアミド溶液を、1.5モルの6アミノヘキサノイック酸とpH7.0の75ミリモルオールで構成される3xゲルバッファーのアリコートと組み合わせます。バッファーに追加するアクリルアミドビスアクリルアミド溶液の量は、グラジエントゲルを作るために作るゲルの割合によって異なります。

4%ミックスと13%ミックスを1つずつ作り、スタッキングジェルは3.5%ミックスになります。13%ミックスにグリセロールを追加することを忘れないでください。3つの混合物すべての準備ができたら、混合物に硫酸塩とテミドごとに適切な量のアンモニウムを追加し、混合物を勾配成形チャンバーに注ぎます。

チャンバーの左側には5%ミックスが含まれています。チャンバーの右側には、小さな磁気攪拌バーに13%の混合物が含まれています。チャンバーの右側を開いてゲルを注ぎ始めます。

次に、すぐにチャンバーの左側を開き、5%溶液を13%溶液と混合して勾配を作ります。ゲルの上部に少量のイソプロパノールを添加して、重合後のゲルにシャープな直線の境界線を形成します。約1時間後、グラジエントゲルの重合が完了したら、イソプロパノールを除去し、3.5スタッキングゲルを装置内に注ぎ、ゲルコームを挿入します。

ゲルを組み立て、摂氏約4〜7度の冷蔵室で泳がせます。このゲルを泳動するために、2つの異なるバッファーを使用します。アノードチャンバーでは、25ミリモルのオール塩酸pH7.0を含むバッファーを使用します。

カソード緩衝液には、50ミリメートルのトリク、7.5ミリモルのオール塩酸、体積あたり0.02%の重量、ドイルベータDマルチサイドまたはDDMおよび0.05%の重量、デオキシコーティングpH7.0が含まれます。注いだばかりのゲルで上清を泳動する準備をするために、ローディングバッファーを添加して、グリセロール体積に対して5%重量、体積に対して0.01%重量の最終濃度を生成します。Ponto Sは、通常、グリセロールとポンチョを含む10倍ストック溶液を上清に直接加えます。

これで、ゲルサンプルをゲルにロードする準備が整いました。レーンあたり20〜40ミリグラムの粗ミトコンドリアタンパク質を含む容量でゲルウェルをロードします。ロード直後に、ゲルを100ボルトで泳動します。

サンプルがスタッキングゲルに入ると、電圧を500ボルトに上げ、電流を15ミリアンペアに制限できます。通常、ゲルを70〜100ボルトで一晩流しますが、赤いzos色素の鋭い線がゲルの前面に近づくと電気泳動を停止します。ゲルを泳動したので、ゲル内で直接、さまざまなタンパク質複合体の活性を解析することができます。

各アッセイのインキュベーション時間は、タンパク質の可溶化効率とウェルあたりの材料ロード量によって異なります。通常、錯体1、4、5は、錯体2、3よりも強いシグナルを発します。これが、複雑な2および3の染色時間を長くする必要がある理由です。

複雑なアクティビティをテストするには、各複合体に特定のバッファを使用する必要があります。個々のバッファーの成分は、書かれたプロトコルに記載されています。次に、ゲルの個々のレーンを切り取り、Ingel活性アッセイを別々に実行します。

すべての複合体について、複合体5を除くすべての複合体について、ゲルスライスをそれぞれのバッファーで室温で数時間インキュベートします。インキュベーション後、ゲルを50%メタノールと10%酢酸に15〜45分間固定します。固定ゲルは10%酢酸で保存されます。

ここでは、複雑なものの染色がどのように現れるかがわかります。ゲルスライスには、複雑なバンドに対応する1つの濃い紫色のバンドがあります。透明ゲルを使用すると、ミトコンドリア複合体の活性からデンシトメトリーを実行し、比較分析を行うことができます。

高密度サイトメトリーの後、通常、ゲルスライスを乾燥させて長期保存したり、スキャンしたりして高品質の画像複合体を得るため、2つの染色物が1つの複合体3および複合体4と同じ紫色の染色物になります。どちらもオレンジ色または黄色がかった染色帯を与えます。ここでは、複雑な2つ、3つ、4つの染色活動の例を示します。

胚性幹細胞から抽出され、ネイティブゲルエレクトロを含む高分解能で分離されたミトコンドリア滲出性イオン複合体の活性を分析する方法を示しました。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。