Name: ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶ ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体のin gel活性アッセイによる機能解析手法。高分解能クリアネイティブ電気泳動を用いて、幹細胞生物学におけるミトコンドリアの役割を詳細に調査します。

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Teitellラボでヒト胚性幹細胞の研究は現在、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）種子助成RS1 - 00313でサポートされています。我々は、これらおよびその他の研究でアドバイスや洞察を提供するための博士カルラケーラー（UCLA）とケーラー研究室のメンバーに感謝。

ゲル内活性測定法ミトコンドリア複合体のための高解像度のクリア天然ゲルのElectophoresis（hrCNE） ヒト胚性幹細胞（ヒトES）は、標準的な条件を使用してMEF -馴化培地中で5日間マトリゲル上での成長に切り替えたˠ照射またはマイトマイシンC処理したマウス胚性繊維芽細胞（MEF）、の単層上で維持された。 MEFSを汚染除去するには、ヒトES細胞をマトリゲル上に再播種し、さらに3日間MEF -馴化培地中で増殖させた。多分化能マーカーOCT - 4およびSSEA - 4の免疫蛍光顕微鏡は、hESCの分化の欠如を確認するために使用されていました。 <ol><li> 5分間トリプシン処理（6ウェルプレートにウェル当たり1 ×トリプシンを1ml）に続いて暖かい1 × PBS、pH7.4の、で細胞を洗浄する。 </li><li>新鮮なトリプシンインヒビター（1X PBSで1mg/ml、pH7.4）を等量の。 200グラムで細胞を回収し、遠心分離、5分間、室温。 </li><li>作りたての1&#39;プロテアーゼインヒビターカクテルと、1.7ミリリットル（細胞ペレットのサイズに基づいて）氷冷ミトコンドリア分離バッファー（6.6mMイミダゾール/ HClを、pH 7.0の83mMスクロース）の - 0.8の上清と再懸ペレット化した細胞を捨てる。氷上で10分間インキュベートする。 </li><li>ホモジナイザー（ - 50ストローク〜40）で細胞をダウンス。光顕微鏡を用いて均質化の完全性をチェックするためにトリパンブルーでdounced細胞のアリコートを染色。 </li><li> 4℃で10分、20,000 gで遠心° Cにも核と大きな細胞断片が含まれている原油ミトコンドリアペレットを得た。デカントして上清を破棄し、析出した粗ミトコンドリアペレットの重量を量る。これは、停止点の場合、ペレットを液体窒素中で° C以下の瞬間冷凍-80℃で保存することができます。 注記：差動遠心分離または他の勾配に基づく手続きは純粋なミトコンドリア膜画分を分離して収集するために使用することができます。 refを参照してください。詳細については4。この代替アプローチは、ミトコンドリアタンパク質の代わりに細胞の重量または細胞数mg当たり複雑な活動のmg当たりミトコンドリア複合体の活性が得られます。ミトコンドリアタンパク質の濃度は、この比較を行うために精製した後に決定する必要があります。また、別の分離バッファは、このアプローチのために必要となる場合があります。純粋なミトコンドリア膜画分の可溶化のために、以下のステップ6次の注を参照してください。 </li><li>氷冷可溶化バッファー（50mmのNaClを、50mmのイミダゾール/ HClでpHを7.0、1mMのEDTA、2mMの6 - アミノヘキサン酸）とボルテックスで氷の上で原油ミトコンドリアペレットを可溶化。 6 - アミノヘキサン酸は、1 ×プロテアーゼインヒビターカクテルに置き換えることができます。ペレットの重量の20mgのあたりの可溶化バッファーの35μlを使用してください。チューブをタッピングしペレットの重さとミックスの20mgを10％w / vのジギトニンの20μlのを追加。氷上で5〜10分間インキュベートする。ドデシル- BD -マルトシドまたはトリトンX - 100は、タンパク質を可溶化するためにジギトニンに置き換えることができます。洗剤とその量の選択は、supercomplexesまたはミトコンドリアの複合体の多量体の形態の形成に影響を与える可能性があります。詳細については、文献1を参照してください。 注：純粋なミトコンドリア膜画分を可溶化するために必要な洗剤の量は2〜6グラム/ gからまで洗剤/蛋白質の重量比に対応していますミトコンドリア膜を可溶化するための最適な比率は、ジギトニンのためのドデシル- BD -マルトシド、トリトンX - 100のための3G / gであり、6グラム/ gのG / 2.5グラムです。 </li><li> 4℃で15分間、100,000 gで可溶化したペレットを遠心透明な上清を集める。 </li><li>最後の5％（w / v）のグリセロール、0.01％w / vのポンソーS（50％w / vのグリセロール、0.1％w / vのポンソーSローディングバッファーのストック溶液を使用）にローディングバッファーを追加します。 </li><li>レーンあたり原油ミトコンドリアペレットの20 - 40mgのを含むボリュームをゲルのウェルをロードする。 3.5パーセントスタッキングゲルとアクリルアミド勾配ゲル（4 -13％）を使用してください。 注：ゲルの調製と電気泳動条件： ビスアクリルアミドのアクリルアミドと1.5グラム（49.5％T、TはAAとbisAAとCの合計濃度である3％Cはの48グラム：ゲルの調製のために、次のように、アクリルアミド/ビスアクリルアミド（AA / bisAA）3ミックスを使用してください全モノマーに対して架橋剤（bisAA）の割合）。 ゲルバッファー（3&#39;）：1.5Mの6 - アミノヘキサン酸、75mmのイミダゾール、pH 7.0の</li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td>勾配ゲル： </td><td> 4パーセント</td><td> 13パーセント</td><td>ゲルをスタッキング： </td><td> 3.5パーセント</td></tr><tr><td> AA / bisAA 3ミックス</td><td> 2ミリリットル</td><td> 6.5ミリリットル</td><td></td><td> 0.6ミリリットル</td></tr><tr><td>ゲルバッファー3&#39; </td><td> 8.3ミリリットル</td><td> 8.3ミリリットル</td><td></td><td> 2.7ミリリットル</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td> 5グラム</td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7ミリリットル</td><td> 5ミリリットル</td><td></td><td> 4.7ミリリットル</td></tr><tr><td>合計ボリューム</td><td> 25ミリリットル</td><td> 25ミリリットル</td><td></td><td> 8ミリリットル</td></tr><tr><td> 10％のAPS </td><td> 139μL </td><td> 125μlの</td><td></td><td> 67μlの</td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14μL </td><td> 12.5μL </td><td></td><td> 6.7μL </td></tr></tbody></table>陽極バッファー：25mMのイミダゾール/ HClを、pH 7.0の 陰極バッファー：50mmのトリシン、7.5mmのイミダゾール/ HClを、0.02％（w / v）のドデシル- BD -マルトシド、0.05％（w / v）のデオキシコール酸、pH 7.0の 寒い部屋（4-7℃）でゲルを注ぎ、実行する。使用する初期電圧は100Vです。サンプルがスタッキングゲルを入力したとき、電圧は15mA（0.15&#39;14&#39;14 cmのゲル用）に電流に制限を500Vに上げている。赤色のポンソーS染色のシャープなラインがゲルの正面に近づくと電気泳動は3〜4時間後に停止されます。また、ゲルを70 - 100Vの定電圧で一晩実行することができます。 <ol><li>ゲル内の活性をアッセイ。各アッセイのインキュベーションの時間は、タンパク質の可溶化の効率性とウェルあたりにロードされる材料の量に依存します。複合体I、IVおよびVは、通常、複合体IIおよびIIIよりも強いシグナルが得られる。 </li></ol>複雑なI（CI） 数時間室温でCIバッファー（2.5mg/ml NBT; 0.1mg/ml NADH 5mMのトリス- HCl、pH7.4）でゲルスライスをインキュベートする。 CIバッファ：5mMのトリス- HCl、pH7.4の100mlあたり追加： 0.01グラムNADH 0.25グラムNBT 15〜45分間50％メタノールと10％酢酸でゲルを修正。固定ゲルを10％酢酸に保存されています。 複合体II（CII） 数時間室温でCIIバッファー（5mMのトリス- HCl pH7.4の、0.2mmのフェナジンのmethasulfate; 2.5mg/ml NBTコハク酸20mMの炭酸ナトリウム）でゲルスライスをインキュベートする。 CIIバッファ：5mMのトリス- HCl、pH7.4の100mlあたり追加： 200μlの1Mコハク酸ナトリウム 80μlフェナジンのmethasulfate（250mmのPMSはDMSOに溶解） 0.25グラムNBT 私コンプレックスのために説明したようにゲルを修正複雑なIII（CIII） 室温で数時間のため、CIIIバッファー（0.05％の3,3&#39; - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）50mmのリン酸ナトリウム、pH7.2）でゲルスライスをインキュベートする。 CIIIバッファ：50mmのナトリウム - リン酸、pHが7.2の100mlあたり追加： 50mgのジアミノベンジジン四塩酸塩私コンプレックスのために説明したようにゲルを修正複雑なIV（CIV） 数時間室温で、CIVバッファー（0.05％の3,3&#39; - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）、50μMウマ心臓シトクロムc 50mmのリン酸ナトリウム、pH7.2）でゲルスライスをインキュベートする。 CIVバッファ：50mmのナトリウム - リン酸、pHが7.2の100mlあたり追加： 50mgのジアミノベンジジン四塩酸塩 0.1グラムウマ心臓シトクロムc 私コンプレックスのために説明したようにゲルを修正複雑なV（CV） CVバッファ室温（35トリス塩基、税込グリシン、25℃でpHが8.3 ° C、14mmのMgSO 4を 、0.2％w / vの鉛（NO 3）2、8MM ATP）数時間でゲルスライスをインキュベートする。 CVバッファ：ソリューションのあたり100ミリリットルを追加： <table border="0"><tbody><tr><td>トリス塩基</td><td> 0.424グラム</td></tr><tr><td>グリシン</td><td> 2.026グラム</td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td> 0.345グラム</td></tr><tr><td>鉛（NO 3）2 </td><td> 0.29グラム</td></tr></tbody></table> （8.3でなければなりません）、pHを調整する必要はありません - 酸または塩基を使用しないでください。フィルタリングと追加<table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441グラム</td></tr></tbody></table> 30分間50％メタノールでゲルを修正し、水に移す。

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

このビデオでは、我々は、ヒト胚性幹細胞、高解像度の明確なネイティブゲル電気泳動（hrCNE）によるそれらの分離、およびゲル内触媒活性のアッセイによって、その後の解析からミトコンドリアタンパク質複合体の抽出を説明してきました。 hrCNEはブルーネイティブゲル電気泳動に匹敵する解像度でミトコンドリアの膜タンパク質複合体を解決し、ゲル内活性アッセイ用に優れています。この手法は、ミトコンドリアの呼吸器複合体IVを定量化するだけでなく、ヒトES細胞およびその派生子孫の両方の任意のミトコンドリア膜タンパク質複合体のサブユニットの組成を分析するだけでなく、使用することができる。

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>NaOHでpH 8.0に調整</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M コハク酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0.1M リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 および BP329-1</td><td>1M Na2HPO4 68.4 ml と 1M NaH2PO4 31.6 ml を混合し、25 C で pH 7.2 の 0.1M リン酸ナトリウム緩衝液を調製する</td></tr><tr><td>1M Tricine, pH 7.0 (NaOHで調整)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>4 C で保存</td></tr><tr><td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>4 C で保存</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>水に溶解。1 ml ずつ分注し &amp;#8211;20 C で保存。</td></tr><tr><td>10% (wt/vol) ジギトニン (&amp;gt;50% 純度、再結晶なしで使用)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>水に溶解。0.1&amp;#8211;1 ml ずつ分注し &amp;#8211;20 C で保存。使用前に 95 C まで加温すること。</td></tr><tr><td>2M 6-アミノヘキサン酸</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>4 C で保存</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/グリセロールストック溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 および G6279-1L</td><td>水中で 0.1% Ponceau S, 50% glycerol (wt/vol)。</td></tr><tr><td>10% w/v デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>水に溶解。遮光保存のこと。HClでpH 7.0に調整し、ろ過後、室温で保存。</td></tr><tr><td>250 mM フェナジンメタサルフェート (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>DMSOに溶解し分注。 &amp;#8211;20 C で保存。</td></tr><tr><td>ニトロブルーテトラゾリウム (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-ジアミノベンジジン四塩酸塩 (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&amp;rsquo;-三リン酸二ナトリウム塩 (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>グレード I、純度 99% 以上</td></tr><tr><td>還元型 β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>シトクロム c (ウマ心臓由来)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>&amp;#8211; 20 C で保存。</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー染色液 0.4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x トリプシン (0.5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

ミトコンドリア細胞の代謝とホメオスタシス、細胞シグナル伝達ネットワークの制御、およびプログラム細胞死の主要な役割を持つ細胞質小器官です。ミトコンドリア農産物ATPは、細胞質酸化還元状態とCa2 +のバランスを調節脂肪酸を異化する、ヘム、ヌクレオチド、ステロイドホルモン、アミノ酸を合成し、タンパク質に鉄硫黄クラスターを組み立てるのに役立ちます。ミトコンドリアはまた、熱産生に不可欠な役割を持っている。ミトコンドリアゲノムの変異は、ヒトの疾患のいくつかのタイプを引き起こす。ミトコンドリアDNAの変異の蓄積は、老化や癌の発症において重要な役割を果たしていると疑われると相関する。すべての細胞型におけるそれらの極めて重要な役割のために、ミトコンドリアの機能はまた、幹細胞にとって重要でなければなりません。キーの進歩は、幹細胞の生存、増殖、及び分化能の我々の理解がなされている。しかし、幹細胞の機能活性は、特定の彼らのエネルギー状態で、まだ詳細に研究されていませんでした。ほとんど何もヒト胚性幹細胞（ヒトES）とそれらの差別化前駆体の子孫のミトコンドリアの性質については知られていない。ヒトES細胞の機能と発達の可能性のミトコンドリアの役割を理解し評価する一つの方法は、直接ミトコンドリアの呼吸器複合体の活性を測定することです。ここで、我々は、ヒトES細胞五呼吸鎖複合体を分析するための方法として、ゲルの活動の可視化で、高解像度明確なネイティブゲル電気泳動およびその後について説明します。

このビデオでは、我々は、ヒト胚性幹細胞のミトコンドリアの呼吸鎖複合体は、ゲルの活性アッセイに使用して分析できる方法を紹介します。

ミトコンドリアは細胞質小器官であり、細胞の代謝と恒常性の維持、細胞シグナル伝達ネットワークの調節、および…において主要な役割を担っています。

ミトコンドリアは、代謝やエネルギー産生からプログラム細胞死、ステロイドホルモン合成に至るまで、細胞生理において数多くの役割を担っています。基礎的な細胞機能および疾患におけるミトコンドリアの重要性にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞およびその分化後細胞におけるミトコンドリアの機能については、ほとんど分かっていません。このビデオでは、インゲル活性測定法を用いて、ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体をどのように解析するかを説明します。こんにちは。私はカリフォルニア大学ロサンゼルス校、病理学・臨床検査医学科のMichael Tetel研究室のIvan OVです。本日は、ヒト胚性幹細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体機能の評価手順について解説します。このin gel activity assayの手順には、ヒト胚性幹細胞からの粗ミトコンドリア画分の単離、高分解能のClear Native polyacrylamide gel electrophoresisによる酸化的人酸化系ミトコンドリア複合体の分離、およびその後のin gel activity assayが含まれます。それでは開始しましょう。この手順の最初のステップは、ヒト胚性幹細胞からミトコンドリアを単離することです。このアッセイでは、フィーダーフリー条件下でマトリゲルコートプレート上で培養したヒト胚性幹細胞を使用します。ヒトamry幹細胞からミトコンドリアを回収するために、まず温めた1x PBS pH 7.4で細胞を洗浄し、次いでトリプシン処理を5分間行います。6ウェルプレートの場合、1ウェルあたり1xトリプシンを1 mL使用してください。5分後、1x PBSに溶解したトリプシンインヒビター（1 mg/mL）を同量加えて反応を停止させ、細胞を回収します。回収した細胞を、室温で200 ×gにて5分間遠心分離します。遠心後、上清を捨て、新しく調製した1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷ミトコンドリア単離バッファー0.8〜1.7 mLで、ペレット化した細胞を再懸濁します。使用するバッファーの量は、得られた細胞ペレットの大きさに合わせて調整してください。ペレットを再懸濁した後、氷上で約10分間インキュベートします。インキュベーション後、ホモジナイザーを用いて細胞を破砕します。これには約40～50回のストロークが必要です。ホモジナイズが完全に完了したかどうかは、DOD細胞のアリコートをトリパンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察することで確認できます。その様子は次のようになります。これはダウンズ（downs）で50回ストロークした後の1回目のショットです。これはダウンズで80回ストロークした後の2回目のショットです。細胞を均質化した後、4 °Cで20,000 ×g、10分間遠心分離します。これにより、核や大きな細胞断片も含まれる粗ミトコンドリアペレットが得られます。ペレットを回収する前に、後のペレット重量を推定するために回収チューブを計量し、上清を捨ててから、沈殿した粗ミトコンドリアペレットの重量を計量します。この時点でのチューブの重量を差し引くことで、次のステップで説明するペレットの可溶化に進むことができます。粗ミトコンドリアペレットを可溶化するために、まずペレットを氷上に保持し、35 µLの氷冷可溶化バッファーを加えてボルテックスします。詳細情報を有するペレット20 mgにつき、使用する緩衝液成分は付随する書面プロトコルに記載されています。ボルテックス処理および可溶化緩衝液の添加後、ディジトニンを添加する前に、再懸濁したペレットを高速度遠心分離に適したチューブに移します。次に、ペレット重量20 mgに対して10% (w/v) ディジトニンを20 µL添加し、チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。十分に混合した後、ミトコンドリアペレットを氷上で5～10分間インキュベートします。タンパク質を可溶化させるために、ディジトニンの代わりにn-ドデシル-β-D-マルトシド（DDM）またはTriton X-100を代用することができます。界面活性剤の選択およびその量は、氷上でのインキュベーション後におけるミトコンドリア複合体の超複合体またはマルチマー形態の形成に影響を及ぼす可能性があります。ペレットを可溶化した後、4°Cで100,000 ×gにて15分間遠心分離し、透明な上清を回収します。これで、ミトコンドリアのネイティブ勾配ゲル電気泳動を行うための、勾配ゲル用上清の準備が整いました。5～13%のアクリルアミド勾配ゲルと3.5%のスタッキングゲルの使用を推奨します。ゲルの調製には、記載のプロトコルに従い、アクリルアミド・ビスアクリルアミド混合液を使用します。アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液はあらかじめ調製し、4°Cの暗所で保存しておきます。アクリルアミドおよびビスアクリルアミドは、粉末および液体の両形態で毒性がある化学物質であるため、取り扱いには細心の注意を払う必要があります。アクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液に、1.5 molar 6-アミノヘキサン酸および75 millimolar OLET（pH 7.0）で構成される3倍濃縮ゲルバッファーを分注して混合します。バッファーに添加するアクリルアミド・ビスアクリルアミド溶液の量は、グラジエントゲルを作成する際に設定するゲルのパーセンテージによって異なります。4%混合液と13%混合液をそれぞれ1つずつ作成し、スタッキングゲルには3.5%混合液を使用します。13%混合液にグリセロールを添加することを忘れないでください。3つの混合液がすべて準備できたら、適切な量の過硫酸アンモニウムとTEMEDを添加し、混合液をグラジエント形成用キャスティングチャンバーに流し込みます。チャンバーの左側には5%mixが含まれています。チャンバーの右側には、小型のマグネチックスターラーと共に13%mixが含まれています。チャンバーの右側を開けて、ゲルの注入を開始します。その後、すぐにチャンバーの左側を開き、5%溶液を13%溶液と混合させてグラジエントを作成します。重合後のゲルの境界線を鋭く直線的にするため、ゲルの上部に少量のイソプロパノールを加えます。約1時間後、グラジエントゲルの重合が完了したら、イソプロパノールを取り除き、3.5%のスタッキングゲルを装置に流し込んでからゲルコームを挿入します。ゲルの組み立てと泳動は約4～7°Cの低温室で行います。このゲルの泳動には、2種類の異なるバッファーを使用します。陽極槽には、25 mMの塩酸 pH 7.0を含むバッファーを使用します。カソードバッファーは、50 mM Tris, 7.5 mM HCl, 0.02% (w/v) DDM (n-dodecyl-β-D-maltoside), および 0.05% (w/v) 脱キシコール酸 (pH 7.0) を含有します。先ほど作製したゲルで泳動させるための上清を調製するには、最終濃度が 5% (w/v) glycerol および 0.01% (w/v) Triton X-100 となるようにローディングバッファーを添加します。通常は、glycerol と Triton X-100 を含む 10倍濃縮ストック溶液を上清に直接添加します。これで、サンプルをゲルにロードする準備が整いました。1レーンあたり20～40 mgの粗ミトコンドリアタンパク質を含む量をゲルのウェルにロードします。ロード後、直ちに100 Vでゲル電気泳動を行います。サンプルがスタッキングゲルに進入したら、電流を15 milliampsに制限した状態で、電圧を500 voltsまで上げることができます。通常は70 to 100 voltsで一晩ゲルを流しますが、赤色のzos染料の鮮明なラインがゲルの先端に近づいた時点で電気泳動を停止します。ゲルの泳動が完了したので、さまざまなタンパク質複合体の活性をゲル内で直接分析することができます。各アッセイのインキュベーション時間は、タンパク質の可溶化効率およびウェルあたりのロード量によって異なります。通常、複合体1、4、5は複合体2および3よりも強いシグナルが得られます。そのため、複合体2および3の染色時間はより長く設定する必要があります。複合体の活性を試験するためには、各複合体に応じた特定のバッファーを使用する必要があります。個々のバッファーの成分は、記述プロトコルで確認してください。次に、インゲル活性アッセイを個別に実施するため、ゲルの各レーンを切り出します。複合体5を除くすべての複合体について、ゲルスライスをそれぞれのバッファーに入れ、室温で数時間インキュベートします。インキュベーション後、50%メタノールおよび10%酢酸でゲルを15〜45分間固定します。固定したゲルは10%酢酸で保存します。ここでは、複合体Iの染色結果が示されています。ゲルスライス内に、複合体Iに対応する濃い紫色のバンドが1本確認できます。ゲルが透明であれば、ミトコンドリア複合体活性のデンシトメトリー測定および比較解析を行うことが可能です。高密度サイトメトリーの後、通常、長期保存またはスキャンによる高品質な画像の取得のためにゲルスライスを乾燥させます。複合体2は、複合体3および複合体4と同じ紫色の染色を示します。どちらもオレンジ色または黄色がかった染色バンドを与えます。以下に、複合体2、3、および4の染色活性の例を示します。以上で、ヒト胚性幹細胞から抽出され、ネイティブゲル電気泳動を含む高分解能の手法で分離されたミトコンドリア分泌複合体の活性を分析する方法について解説しました。これで本ビデオを終了します。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。...

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。...

ミトコンドリア病モデルのためのヒト脳オルガノイドの生成

以前に凍結したアーカイブされた固体組織からのミトコンドリア濃縮サンプルを調製し、研究者は様々な実験モダリティでミトコンドリアの機能的および分析的評価を行うことを可能にした。この研究は、凍結した心臓組織からミトコンドリア濃縮製剤を調製し、ミトコンドリアの分析評価を行う方法を示す。...

ソウの子孫から以前に凍結した心臓組織におけるミトコンドリア電子伝達複合体の測定:運動誘発ミトコンドリアバイオエネルギーの変化を評価するモデル

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。...

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

学ぶ ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体のin gel活性アッセイによる機能解析手法。高分解能クリアネイティブ電気泳動を用いて、幹細胞生物学におけるミトコンドリアの役割を詳細に調査します。

ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

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