ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4
2008年4月7日
このビデオでは、誘導レンチウイルスを用いて誘導多能性幹細胞を生成するための手順を示して発現するOct4は、レトロウイルスベクター、c - MycおよびKLF4。
50年以上前、皮膚線維芽細胞などの末期分化細胞が、胚性幹細胞と同様の多能性状態を強いられるという仮説が立てられていました。この概念の基礎は、いくつかの小さな例外を除いて、すべての細胞タイプが同じ遺伝暗号を持っており、細胞タイプ間の唯一の違いはコードの読み取り方法であるという観察でした。分化した細胞の細胞同一性を多能性状態に変えるこの能力は、細胞リプログラミングと呼ばれます。
50年にわたる研究の結果、最近、4つの転写因子の強制発現により、皮膚の線維芽細胞を再プログラムして多能性にすることができることが示されました。この発見の影響は甚大です。基礎生物学の重要性だけでなく、移植治療にヒト胚性幹細胞を使用することに対する主要な倫理的反対意見も克服しています。
リプログラミングを行うためには、転写因子OCをコードする4つの遺伝子、OCをコードする4つの遺伝子、4つのSox、2つのcmic、およびK4をパッケージ化してレンチウイルス組織培養に入れる必要があります。そして、高濃度の線維芽細胞が入った細胞培養皿に、精製したウイルスが入った培地を加えると、その皿の中ですごいことが起こります。線維芽細胞のごく一部が、ウイルスを運ぶ4つの転写因子すべてに感染し、脱分化し始めます。
それらは形態と増殖に劇的な変化を遂げ、形成された多能性幹細胞の大きな霊的クラスターに分裂し始めます。胚性幹細胞条件で2〜3週間培養した後、再プログラムされた線維芽細胞のコロニーを手動で単離し、in vitroで増殖させることができます。精製されると、これらの細胞は、これらの脱分化した線維芽細胞に由来する細胞の一定の割合がマウスの異なる組織に寄与することができるキメラマウスを生成するために使用することができる。
元の線維芽細胞の遺伝物質が生殖細胞系に貢献したチャイムでは、遺伝暗号は次の世代に受け継がれ、次に次の世代、そして次の世代に受け継がれます。現在、ウイルス送達システムの使用は臨床応用の障害となっていますが、これはすぐに克服されるでしょう。このビデオでは、陰研究室のメンバーが、誘導された強力な幹細胞がマウス胚性線維芽細胞にどのように由来するかを示します。
こんにちは、マサチューセッツ州ケンブリッジにあるホワイトヘッド生物医学研究所のルドルフ・ジッシュ研究室のグラント・ウェルテッドです。そして、私もish labのTobias Bro brinkです。本日は、TET OCMVプロモーターからこれらの4つのCDNAを発現するレンチウイルスを用いて、OCT4、SOX2、CIC、KF4の4つのCDNAを導入し、人工多能性幹細胞を作
製する様子をご紹介します。これにより、マウス胚性線維芽細胞の感染後に、これら4つの導入遺伝子の発現を正確に制御することができます。今日お見せするプロトコルは、ヒト細胞に感染する可能性のあるレンチウイルスの取り扱いに関するものです。自分でこれを行う前に、常に安全な手順に従い、安全オフィスに連絡することが重要です。
では、mesをIPS細胞に変換するレンチウイルスを生成するために、いくつかのIPS細胞を生成しましょう。2 9 3細胞には、ウイルスパッケージングに必要な遺伝要素を提供する3つのプラスミドとPaks2をトランスフェクションする必要があります。ウイルス骨格は、FUW TE OCMV レンチウイルスであり、T 4 SOX 2、KLA 4、または CMIC PMDG の 4 つの CD エイドのいずれかを持つもので、水疱性口内炎ウイルスまたは VSV のエンベロープ糖タンパク質を発現します。
これにより、アトロピックウイルスを生成するウイルスが作られます。したがって、適切なBLツープラス手順に従う必要があります。このビデオでは、実際には感染性ウイルスを扱っていないため、通常のガウンを着ておらず、BLの2プラス施設にもいません。
トランスフェクション2に先立って、9 3細胞を液体窒素から解凍し、90%Coに増殖させます フルーエンシー細胞は、次にFU遺伝子でトランスフェクションされ、ウイルスを発現するために48〜72時間与えられます。その時点で、細胞を浸す培地を0.45ミクロンフィルターを使用してろ過し、ウイルスを濃縮した後、超遠心分離を使用して濃縮します。ウイルス調製ステップ中に、マウス胚性線維芽細胞の通過が3回未満で、10センチメートルの皿で90%coの流暢さに成長し、皿ごとに10の約2倍の6細胞に成長します。この特定の実験プロトコルでは、ドキシサイクリンの発現に重要なRTTAを発現するMESと、内因性OC4遺伝子座からのGFPを使用しています。
MESはGFP陰性ですが、真のIPS細胞はGFP陽性になります。このマーカーは、再プログラムされたmesを識別し、線維芽細胞から培養液を吸引し、10ミルのヒッピー、EDTAで洗浄し、ヒッピーEDTAを廃棄し、5ミルの1回トリプシンを追加し、37度で10分間インキュベートする方法を可能にします。トリプシンは、皿の底から細胞を持ち上げるのに役立ちます。
次に、9ミルの培地を加えて、細胞を単一細胞懸濁液に再懸濁し、15ミルのチューブに移します。次に、これらの細胞をスピンダウンしてペレット化します。ペレットを懸濁した後、懸濁液中の細胞数をカウントし、濃度を10の8倍から1ミルあたり4個の細胞に調整します。
次に、10ミルの細胞懸濁液をゼラチンでコーティングした10cmの皿に移します。皿を摂氏37度で5%CO2で一晩インキュベートした後、線維芽細胞皿からの培地を吸引し、10ミルのウイルス含有培地を覚醒剤に加えます。細胞を摂氏37度、5%CO2で4時間から一晩インキュベートします。
翌日、ファイバーブラスト皿から培地を吸引し、10ミルの新鮮なESL培地を加えます。この段階では、細胞を凍結、拡張、または再プログラミングの開始に備えることができます。リプログラミングを開始するには、通常のESL培地をドキシサイクリンを含む培地に置き換えて、4つの遺伝子の発現を開始します。
これらの細胞をインキュベーターに入れ、コロニーが摘み取るのに十分な大きさになるまで、毎日培地を交換します。コロニーは、再プログラミングの開始から約1週間後に最初に見えるようになるはずです。それらは20日目頃に拾うのに十分な大きさになるはずです。
20日が経過した今、コロニーを選ぶ前にIPSコロニーを選ぶことができます。1つは、ピッキングの1〜2時間前に、ガンマ線照射DRの4つの神話でゼラチンコーティングされた24ウェルプレートの必要な数を見ることを覚えておく必要があります。1つは、ピッキングの直前に新鮮な培地を追加し、ピッキング直前にV底96ウェルディッシュのウェルにHEPA緩衝液の50マイクロリットルを追加し、PBSで一度ピッキングするコロニーを含むディッシュを洗浄し、PBS細胞クラスターをディッシュIPS細胞クラスターのいずれかの下でピッキングすることができる新鮮な培地を添加することによって、プレート上のコロニーを供給する必要があります。
小さなピペットチップでコロニーを選び、PBSを含む96ウェルディッシュのウェルに移して、クラスターを除去します。クラスターの周りにピペットの先端が付いた円が描かれ、計算が分割されます。これで、再プログラムされた細胞をマルチチャンネルピペッターを使用して抽出できるようになり、それぞれに20マイクロリットルのトリプシンが追加されます。
よくパイプで3回上下させ、37°Cで4分間インキュベートします。4分間のインキュベーション後、100マイクロリットルのES培地をトリップスナイスコロニーに加えます。10回上下にパイプし、一度に6つのクローンを転送します。
96ウェルディッシュから24ウェルディッシュまで、12場所の他のすべての位置でチップを使用して、ピペッター細胞は、その後、細胞が80〜90%Coに達するまで、37セント度、5%CO2インキュベーターで24ウェルプレート上で成長しますES細胞培地細胞とデリに適合するデリは、おそらく3〜7日後に拡大する準備ができています。IPS細胞がコンフルエントになったので、培地を吸引し、1ミルのヒッピーで細胞を完全に洗浄します ヒッピーを取り除き、100マイクロリットルの1回トリプシンを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンとインキュベートした後、400マイクロリットルのESL培地を加え、ピペッティングで上下させて細胞を懸濁し、単一細胞懸濁液を作製します。
次に、24ウェルからの500マイクロリットルのシングルセル懸濁液を6ウェルプレートのシングルウェルに移し、37°Cの5%CO2インキュベーターでインキュベートし、細胞が6ウェルプレートで80〜90%coの流暢さに達するまでインキュベートします。この時点で、サザン分析、芽球、注射、奇形腫アッセイ、またはin vitro分化アッセイのいずれかで細胞を増幅することができます。そして、IPS細胞のこの貴重なストックを失わないように、これらの細胞のストックバルブを凍結することを忘れないでください。
今回、誘導性抗ウイルスシステムを用いてマウス胚性線維芽細胞に多能性を誘導する方法をお見せしました。だから、見てくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
このビデオは、レンチウイルスシステムを使用してマウスの胚性線維芽細胞から誘導多能性幹細胞（iPSC）を生成する手順を示しています。この方法は、分化した細胞を多能性状態にリプログラミングするために不可欠な4つの転写因子：Oct4、Sox2、c-Myc、およびKlf4の導入を含みます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞のリプログラミング
- 幹細胞生物学
- 遺伝子送達システム
背景
- 末梢に分化した細胞は多能性状態にリプログラミングすることができます。
- このプロセスは胚性幹細胞に関連する倫理的懸念を克服します。
- 4つの転写因子はリプログラミングプロセスにとって重要です。
- レンチウイルスベクターはこれらの因子を標的細胞に送達するために使用されます。
研究の目的
- マウスの胚性線維芽細胞からiPSCを生成することを示す。
- 細胞のリプログラミングにレンチウイルスを使用するための詳細なプロトコルを提供する。
- 再生医療におけるiPSCの意味を強調する。
使用された方法
- レンチウイルスを生産するための293細胞のトランスフェクション。
- レンチウイルスによるマウスの胚性線維芽細胞の感染。
- 胚性幹細胞の条件下での感染細胞の培養。
- iPSCコロニーの分離と増殖。
主な結果
- 線維芽細胞からiPSCへの成功したリプログラミング。
- 数週間の培養後に多能性幹細胞コロニーの形成。
- リプログラミングされた細胞からキメラマウスを生成する可能性のデモンストレーション。
- レンチウイルスの取り扱いに関する安全性プロトコルの議論。
結論
- このプロトコルはiPSCを生成するための信頼できる方法を提供します。
- 将来の応用はウイルス送達システムの現在の限界に対処する可能性があります。
- この研究は再生医療および細胞治療の分野に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Induced pluripotent stem cell (iPSC) generation from somatic cells enables target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing a renewable, disease-relevant human cell source. This approach supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies prior to lead identification. The inducible lentiviral system described allows temporal control of reprogramming factor expression, facilitating kinetic analysis of gene requirements and reducing ambiguity in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through differentiation of iPSCs into disease-relevant cell types for target engagement assays.
- Operational Value: Provides a scalable, renewable source of human cells for consistent target validation across projects.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing controlled expression of reprogramming factors to study gene dependency in reprogramming kinetics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems suitable for assay standardization and compound screening in disease models.
- Operational Value: Enables preparation of homogeneous cell populations for reproducible, quantitative readouts in high-throughput formats.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets and therapeutic areas through banked iPSC lines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: iPSCs derived from patient-specific somatic cells enable disease-relevant systems for preclinical efficacy and safety testing.
- Biomarker Alignment: Facilitates identification and validation of translational biomarkers through differentiation into functional cell types.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing human-relevant data to de-risk targets before animal studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical research by providing a renewable source of disease-relevant human cells for target interrogation and compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling differentiation of iPSCs into disease-relevant cell types for target validation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized cell populations with quantitative outputs for reliable compound screening and hit confirmation.
- Analytics: Provides measurable outputs such as colony formation kinetics, marker expression (e.g., GFP), and differentiation efficiency to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work through patient-derived iPSC models that reflect human disease genetics and pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating and banking iPSC lines across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through controlled, inducible reprogramming systems.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of cell-based assays via defined, banked iPSC resources.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling early de-risking of targets using human-relevant models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on translational biomarker data and phenotypic screening outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector production, cell culture, and stem cell biology.
- Necessitates biosafety level 2+ infrastructure and training for lentivirus handling.
- Demands standardization of differentiation protocols across teams for reproducible outputs.
- Involves adaptation considerations for different genetic backgrounds and disease-relevant cell types.
- Includes practical limitations such as viral insertional mutagenesis risk and epigenetic memory in iPSC lines.
