Name: ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学ぶマウス胚性線維芽細胞からのiPS細胞生成法。レンチウイルスを用いてOCT4、SOX2、c-Myc、KLF4の4因子を導入し、分化細胞を多能性幹細胞へ再プログラミングする詳細プロトコルを解説する。

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ステップ1： レンチウイルスの生産のための293細胞とプレートを解凍。 <ol><li> 15 mlのチューブにDMEM +培地9mlのを準備します。 </li><li>液体窒素タンクから凍結293株のバイアルを取り出して、（すべてではない）ほとんどの細胞が融解するまで37℃の水浴中にバイアルを入れて。 </li><li>ステップ1から15ミリリットルチューブに凍結バイアルと場所から細胞を取り除きます。 </li><li> 5分間180グラムで遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li> DMEM +培地10 mlで細胞を再懸濁し、そしてゼラチンでコーティングされた100 mmディッシュに移す。彼らは80〜90％コンフルエントになるまで37℃、5％CO 2インキュベーターで細胞をインキュベートする。 </li><li> 293細胞の継代：PBSで洗浄細胞、PBSを吸引除去、および0.05％trypsin/0.53 mMのEDTAの10cmの皿あたり4 mlを追加し、37℃で1分間インキュベート℃に</li><li> 10ミリリットルDMEM +培地で再懸濁し、タップして皿から細胞を剥離し、15 mlのチューブに移す。 5分間180グラムで遠心分離し、上清を吸引除去する。 </li><li> DMEM +培地の適切な量を追加し、数回上下にピペッティングして、単一の細胞懸濁液に細胞を壊す。 </li><li>セルの数をカウントし、FPの培地でmlあたり8 × 10 5細胞に濃度を調整する。 </li><li>種子の100 mm培養ディッシュあたり8 × 10 6個の細胞（10 ml）で、細胞、および37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2。 </li></ol>ステップ2： レンチウイルスプラスミドと収穫のウイルスを293細胞にトランスフェクション<ol><li>各10cmのプレートの場合は、FUW -テト- cDNAの10μgの（Oct4の、レトロウイルスベクター、KLF4またはc - Mycの）PMD - Gの2.5ugとレンチウイルスのバックボーンとpPax2の7.5μgを使用してください。 </li><li>チューブに3つのプラスミドを小分けしながら、血清を含まないDMEMの500μLを含む第2のチューブにFuGENE 6トランスフェクション試薬の30μlのを提供し、室温で5分間指のタッピングとインキュベートすることにより穏やかに混合する。 </li><li> DNA混合物をトランスフェ6/DMEM-containingチューブにドロップでドロップを追加し、20分間、指のタッピングとインキュベートすることにより穏やかに混合する。 </li><li> 293のの皿にDNA /のFugene 6複雑な滴下を追加し、37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2。 </li><li>翌朝：トランスフェクション試薬を含む培地を吸引、新鮮なES細胞培地5mlを追加し、インキュベーターにセルを返します。 </li><li> 48時間とトランスフェクション後72時間で、0.45μmのポアサイズの酢酸セルロースフィルターを通してそれをフィルタリング、および15 mlのチューブに移し、10 mlの滅菌使い捨て注射器を使って、293年代から培地を収集する。 </li><li>超遠心分離によりウイルスの上清を集中する。目的のボリュームにウイルスペレットを再懸濁し、Oct-3/4-、Sox2の - 、KLF4 -およびc - Myc -レンチウイルスを含む培地の等量のamixtureを行います。 </li><li>ウイルスを作成しているときに、10cmの皿（皿あたり2 × 10 6細胞）でコンフルエント90％にOct4-neo/rtTAまたはOct4-GFP/rtTA MEFSを（通路&lt;3）の準備</li><li>培地を吸引除去し、PBSの10mlで洗う。 </li><li> 0.05パーセントtrypsin/0.53 mMのEDTAのディッシュあたり1 mlを追加し、37℃で10分間、PBSを捨てます。 </li><li>培地9mlのを追加し、単一のセルにセルを一時停止し、15 mlのチューブに移す。 </li><li>セルの数をカウントし、mlあたり8 × 10 4個の細胞に濃度を調整する。ゼラチンでコーティングした10cmのディッシュに細胞懸濁液10ml（8 × 10 5細胞）を移します。一晩37皿をインキュベート° C、5％CO 2。 </li><li>線維芽細胞のディッシュから培地を吸引し、そしてウイルスを含む培地10mlを加え。 4時間から37℃で一晩に、細胞をインキュベート° C、5％CO 2を 。 </li><li> 24時間後線維芽細胞のディッシュから培地を吸引除去し、新鮮なES細胞用培地10mlを加え。 </li><li> 4つの遺伝子の発現を開始するためにドキシサイクリンを含む培地で、通常のES細胞用培地を交換し、他の言葉で、再プログラミング開始。 </li><li> Oct4は、ネオレポーターを使用している場合は、6と9日の間いつでも薬剤のセクションを開始する。 </li><li>コロニーをピックアップするのに十分な大きさになるまで、毎日培地を変更します。コロニーは、最初のプログラミングの開始後約週見えるようになります。彼らは20日目の周りにピックアップされるのに十分な大きさになるはず。 </li></ol>ステップ3： iPS細胞コロニーをピックアップピッキング前日： <ol><li> γ線照射DR4 MEFの持つゼラチンコートした24ウェルプレートを必要な数の種子</li></ol> 1日目のクローンをピッキング。 <ol><li> 1〜2時間取る前プレート上のコロニーを養う。 </li><li> V底96ウェルディッシュのウェルにPBS 15μlを添加する。 </li><li> PBSで一度ピックアップし、皿にPBS 10mlのを追加するコロニーを含む皿を洗ってください。 </li><li>小さな5μlのピペットチップ（4μlのP20 pipetmanを設定）を使用してコロニーを選択してください。転送CO96ウェルディッシュにもへロニーズ。 </li><li>よくマルチチャンネル（12）pipetorを使用してそれぞれにトリプシンを20μlを添加する。ピペッティング3回。 37℃で4分間。 </li><li>トリプシン処理コロニーにES培地100μlを加え。ピペッティング10回。 12位pipetor上の他のすべての位置にチップを用いて24ウェルディッシュに96ウェルディッシュから一度に6個のクローンを転送します。 </li><li>細胞はES細胞用培地を毎日供給、80〜90％コンフルエントに達するまで、37 ° C、5％CO 2インキュベーター内で24ウェルプレート上で細胞を成長させる。細胞は、おそらく3-7日で拡大できるようになります。 </li></ol>ステップ4 <ol><li> iPS細胞の拡大<ol><li>培地を吸引除去し、1mlのPBSで細胞を洗浄する。 </li><li>完全にPBSを除去、37℃で0.25％トリプシン/ 1mMのEDTAとインキュベート0.1 mlを加える℃で10分間。 </li><li> ES培地0.4 mlを加え、単一の細胞懸濁液にピペッティングにより細胞を一時停止。 </li><li> 6ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液を転送、1.5 mlのES細胞用培地を追加し、そして細胞は6ウェルプレートでコンフルエント80〜90％に達するまで37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートする。この時点で、次のように、細胞の凍結ストックを準備。 </li></ol></li><li>凍結ストックの調製<ol><li>培地を吸引し、PBS 2mlで細胞を洗浄する。 </li><li>完全にPBSを除去、37℃で0.25％トリプシン/ 1mMのEDTAとインキュベートの0.5 mlを加える℃で10分間。 </li><li> ES培地2 mlを加え、単一の細胞懸濁液にピペッティングにより細胞を一時停止。 </li><li> 15 mlのチューブに細胞懸濁液を転送する、セルの数をカウントし、細胞をスピンダウン。 </li><li> 、上清を捨てmlあたり2 × 10 6個の細胞で濃度にES培地で細胞を懸濁します。 </li><li> 2 ES細胞の凍結培地（ES培地で20％のDMSO）とバイアル当たり0.5 mlのアリコートを、それを準備する。 </li><li>バイアルを凍結し、穏やかに混合して細胞懸濁液0.5 mlを移します。 </li><li>液体窒素に転送する長期保存のための次の日、細胞凍結容器にバイアルを入れ、-80、それを維持℃で一晩。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

このビデオでは、我々はOct4-GFP/R26-M2rtTAとNanog-GFP/R26-M2rtTAマウス由来のMEFからのGFP陽性、多能性iPS細胞を生成するために誘導、レンチウイルスシステムを使用する方法を示します。それはプログラミングプロセス中に導入遺伝子発現の制御が可能なため、この手順では、iPS細胞を生成するための有用な方法です。 iPS細胞の発生におけるウイルスの使用が臨床の現場でこれらの細胞の使用を妨げるが、この手順は、私たちはまだ定義されている更新プロセスを下線主要な生物学的な疑問の幾つかに解答したりすることができます。

<table><tbody><tr><td>ドキシサイクリン塩酸塩</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ソックス- 2の強制発現によってmefsからips細胞を生成し、oct - 4、c - mycの、とklf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

多能性は、Oct4のウイルスの形質導入により差別化されたマウスで誘導することができる、レトロウイルスベクター、KLF4、およびc - Myc（高橋と山中、2006; Wernig、ら、2007;。沖田ら、2007;。。Maherali、ら、 2007年）。我々は、これら4つの転写因子は、ドキシサイクリン（DOX）から発現されるプログラミング戦略を考案したレンチウイルスベクターを（Brambrinkら、2008）誘​​導。これらの誘導の構文を使用して、我々はマウス胚性繊維芽細胞（MEF）から誘導多能性幹（iPS）細胞を得ることができます。このビデオでは、我々は4つの転写因子を発現し、iPS細胞を生成するためにこれらのウイルスとMEFのを感染させる方法を示す誘導レンチウイルスを生成するための手順を示しています。誘導レンチウイルスを使用することにより、培地にdoxycylineを追加することにより制御の4つの因子の発現。従来のレトロウイルス感染に対するこのシステムの利点は、プログラミングと遺伝子発現の要件の動態を詳細に分析できるようにオフの遺伝子をオンとする機能です。

このビデオでは、誘導レンチウイルスを用いて誘導多能性幹細胞を生成するための手順を示して発現するOct4は、レトロウイルスベクター、c - MycおよびKLF4。

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

分化したマウス細胞は、Oct4、Sox2、Klf4、およびc-Mycをウイルスベクターで導入することにより、多能性を誘導することができる（Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

50年以上前、皮膚線維芽細胞のような終末分化した細胞を、胚性幹細胞と同様の多能性状態に強制的に移行させることができるという仮説が立てられました。この概念の根拠となったのは、ごく少数の例外を除き、すべての細胞タイプが同一の遺伝コードを持っており、細胞タイプ間の唯一の違いはコードの読み取り方にあるという観察結果でした。分化した細胞の細胞アイデンティティを多能性状態へと変化させるこの能力は、細胞リプログラミングと呼ばれています。5年間にわたる研究の結果、4つの転写因子を強制的に発現させることで、皮膚線維芽細胞を多能性細胞へとリプログラミングできることが最近示されました。この発見の影響は極めて大きく、基礎生物学における重要性だけでなく、移植治療へのヒト胚性幹細胞の利用に対する主要な倫理的反対意見を克服するものとなります。リプログラミングを可能にするために、転写因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4をコードする4つの遺伝子をパッケージングし、レンチウイルスに組み込む必要があります。精製されたウイルスを含む組織培養培地を、高密度の線維芽細胞を含む細胞培養ディッシュに添加すると、そのディッシュ内で驚くべき現象が起こります。少数の線維芽細胞が4種類すべての転写因子搭載ウイルスに感染し、脱分化し始めます。これらの細胞は形態と増殖に劇的な変化を遂げ、多能性幹細胞からなる大きな球状クラスターへと分裂し始めます。胚性幹細胞の培養条件下で2〜3週間培養した後、リプログラミングされた線維芽細胞のコロニーを手作業で単離し、in vitroで拡大培養することができます。精製されたこれらの細胞を用いてキメラマウスを作製することができ、脱分化した線維芽細胞に由来する一定割合の細胞が、マウスのさまざまな組織に寄与します。元の線維芽細胞の遺伝物質が生殖細胞系列に寄与したキメラでは、遺伝コードが次世代へ、そしてさらにその次の世代へと受け継がれます。ウイルスによるデリバリーシステムの利用は、現状では臨床応用の妨げとなっていますが、これは間もなく克服されると考えられます。本ビデオでは、Yin研究室のメンバーが、マウス胚性線維芽細胞から誘端多能性幹細胞を誘導する方法を実演します。こんにちは。マサチューセッツ州ケンブリッジのホワイトヘッド生物医学研究所、Rudolph Jish研究室のGrant Weltedです。そして、同じくJish研究室のTobias Bro brinkです。本日は、Tet OCMVプロモーターから4つのcDNA（OCT four、SOX two、CIC、KF four）を発現するレンチウイルスを用いて、これらの4つのcDNAを導入することによる人工多能性幹細胞の作製について解説します。これにより、マウス胚性線維芽細胞への感染後、これら4つの導入遺伝子の発現を精密に制御することが可能になります。本日ご紹介するプロトコルでは、ヒト細胞に感染する可能性のあるレンチウイルスの取り扱いを含みます。ご自身で実施される際は、常に安全手順に従い、事前に安全管理部署に連絡することが極めて重要です。それでは、mesをiPS細胞に転換させるためのレンチウイルスを作製するため、iPS細胞を誘導しましょう。293細胞に3つのプラスミドをトランスフェクションさせる必要があります。まず、ウイルスパッケージングに必要な遺伝子要素を提供するpAK2、次に4つのCADの一つ（T4、SOX2、KLA4、またはCMIC）を含むFUW-TE-OCMVレンチウイルスのウイルスバックボーン、そして最後に、水疱性口炎ウイルス（VSV）のエンベロープ糖タンパク質を発現させるpMDGです。これにより、アトロピックウイルスを生成するウイルスが作製されます。そのため、適切なBL2+の手順に従う必要があります。このビデオでは、実際には感染性ウイルスを取り扱っていないため、通常のガウンを着用せず、BL2+施設内での作業も行っていません。トランスフェクションに先立ち、2-9E細胞を液体窒素から融解し、コンフルエンシーが90%になるまで培養します。次に、これらの細胞にFU遺伝子をトランスフェクションし、ウイルスが発現するまで48～72時間おきます。その後、細胞の培養液を0.45 µmフィルターでろ過し、超遠心分離機を用いて濃縮します。ウイルスの濃縮が完了し、iPSクラスターを生成するためのMEFへの感染準備が整いました。ウイルスの調製ステップの間、継代回数が3回未満のマウス胚性線維芽細胞（MEF）を、10 cmディッシュでコンフルエンシー90%まで培養します（1枚あたり約2×10⁶個の細胞）。本実験プロトコルでは、ドキシサイクリン発現に不可欠なrtTAおよび内在性Oct4遺伝子座からのGFPを発現するMEFを使用しています。MESはGFP陰性ですが、真のiPS細胞はGFP陽性となります。このマーカーを用いることで、リプログラミングされた細胞を識別することが可能です。線維芽細胞から培養液を吸引し、10 mLのPBS-EDTAで洗浄します。PBS-EDTAを捨て、1×トリプシンを5 mL加え、37 °Cで10分間インキュベートします。トリプシンによって、細胞がディッシュの底面から剥離します。次に、9 mLの培地を加えて細胞を単一細胞懸濁液として再懸濁し、15 mLチューブに移します。その後、これらの細胞を遠心分離してペレット化します。ペレットを再懸濁した後、懸濁液中の細胞数をカウントし、細胞濃度を8×10⁴ cells/mLに調整します。次に、細胞懸濁液 10 mL をゼラチンでコーティングした 10 cm ディッシュに移します。このディッシュを 37 °C、5% CO2 で一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、線維芽細胞ディッシュから培地を吸引し、ウイルス含有培地 10 mL をディッシュに加えます。細胞を 37 °C、5% CO2 で 4 時間から一晩インキュベートします。翌日、線維芽細胞のディッシュから培地を吸引し、10 mLの新鮮なESL培地を加えます。この段階で、細胞を凍結保存するか、拡大培養するか、あるいは初期リプログラミングの準備を行うことができます。リプログラミングを開始するには、通常のESL培地をドキシサイクリン含有培地に交換し、4つの遺伝子の発現を誘導します。これらの細胞をインキュベーターに入れ、コロニーをピックアップできる大きさになるまで毎日培地を交換してください。コロニーは、リプログラミング開始から約1週間後に初めて視認できるようになります。その後、20日目あたりにピックアップ可能な大きさになります。20日が経過したので、コロニーをピックアップする前にIPSコロニーを選別することができます。ピックアップの1〜2時間前に、ガンマ照射済みDRでコーティングしたゼラチンコート24ウェルプレートが規定数用意されているか確認してください。ピックアップの直前に、プレート上のコロニーに新鮮な培地を加えて栄養補給を行います。ピックアップの直前に、V底96ウェルディッシュの各ウェルに50 µLのHEPAバッファーを加えます。ピックアップ対象のコロニーを含むディッシュをPBSで1回洗浄し、ディッシュに10 mLのPBSを加えます。IPS細胞クラスターのピックアップは、実体顕微鏡または倒立顕微鏡のいずれかを用いて行うことができます。小さなピペットチップでコロニーをピックアップし、クラスターを除去するためにPBSを含む96ウェルプレートのウェルに移します。ピペットチップでクラスターの周囲に円を描くように動かし、塊を分散させます。これで、マルチチャンネルピペットを使用してリプログラミング細胞を抽出でき、各ウェルに20 µLのトリプシンを添加します。ピペッティングで3回的に混和し、37 °Cで4分間インキュベートします。4分間のインキュベーション後、tripps niceコロニーに100 µLのES培地を加えます。10回ピペッティングし、一度に6つのクローンを移送します。12チャンネルピペッターの1つおきのチップを使用して、96ウェルディッシュから24ウェルディッシュへ移します。その後、細胞が80〜90%のコンフルエンシーに達するまで、37°C、5% CO2インキュベーター内で24ウェルプレートを用いて培養します。ES細胞培地で補充を行い、通常3〜7日後に細胞の拡大準備が整います。数日後、iPS細胞がコンフルエントになったら、培地を吸引し、1 mLのHBSSで細胞を洗浄します。HBSSを完全に除去し、1×トリプシンを100 µL加え、37°Cで10分間インキュベートします。トリプシン処理後、ESL培地を400 µL加え、ピペッティングで細胞を懸濁させ、単一細胞懸濁液を作成します。24ウェルプレートから得られた500 µLの単一細胞懸濁液を、6ウェルプレートの1ウェルに移し、細胞が6ウェルプレート内で80から90%のコンフルエンスに達するまで、37 °C、5% CO2 インキュベーター内で培養します。この時点で、サザン分析、ブラスト、注入、テラトーマアッセイ、またはin vitro分化アッセイのための細胞増殖に進むことができます。また、この貴重なiPS細胞のストックを失わないよう、これらの細胞のストック凍結保存を行うことを忘れないでください。以上で、誘導性抗ウイルスシステムを用いてマウス胚性線維芽細胞に多能性を誘導する方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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