Name: カウントと培養細胞の生存率の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-23T15:41:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶヘマサイトメーターを用いた培養細胞の正確なカウントと生存率評価の手法。トルパンブルー染色法で細胞の生死を区別し、実験の標準化と定量化に必要な細胞濃度計算の技術を習得できます。

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この実験的なアプローチのための完全なテキストのプロトコルでは、利用可能です<a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">細胞生物学におけるカレントプロトコール</a> 。

著者に開示すべき事項はありません。

カウントと培養細胞の生存率の決定

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

培養中の細胞の数を決定することは培​​養条件の標準化と正確な定量実験を行う際に重要です。血球計算盤は、カウント室として設計された中央部分と厚いガラスのスライドです。細胞懸濁液は、定義された領域に適用され、細胞密度が計算できるようにカウントされます。

培養中の細胞の数を決定することは培​​養条件の標準化と正確な定量実験を行う際に重要です。このビデオでは、我々は、細胞を血球計を使用してカウントしている方法を示しています。

培養細胞数を決定することは、培養条件の標準化および正確な定量実験を行う上で重要です。...

細胞数および培養状態の決定は、培養条件の標準化や、正確な細胞数を必要とする実験を行う際に重要です。ここでは、ヘモサイトメーターを用いた細胞の計数方法と、懸濁液中の細胞濃度の算出方法について説明します。また、トリパンブルー生存率試験を用いて、培養液中の生存細胞数を決定する方法についても解説します。こんにちは。テネシー州東部の分子病理学研究所ネットワークにあるDr.LANの研究室のRickyです。今日は、懸濁液中の細胞の計数方法と、その生存率の決定方法について説明します。細胞計数用にヘモサイトメーターを準備するには、まず、その表面と付属のカバーガラスを70% ethanolで洗浄します。カバーガラスとスライドガラスは、清潔で乾燥しており、糸くずや指紋、水跡がない状態でなければなりません。次に、ヘモサイトメーターの縁を水道水で軽く濡らし、その上にカバーガラスを押し当てます。カバーガラスがシルバーの計数領域の上に均一に乗るようにしてください。次に、細胞数を計測するための細胞懸濁液を調製します。まず、細胞が単層培養されている場合は、ビデオで示されているようにトリプシンを用いて細胞をプレート表面から剥離させます。細胞がプレートから剥離したら、均一な懸濁液を得るために必要に応じて希釈します。ヘモサイトメーターを使用する際は、懸濁液中の凝集塊を確実に分散させてください。1 mm²あたり最大20〜50個の細胞数に調整することが推奨されます。細胞サンプルをヘモサイトメーターに充填する準備ができたら、マイクロピペッターを使用して、細胞懸濁液をヘモサイトメーターの計数室の端に移動させます。ピペットチップをカバーガラスの下に保持し、懸濁液を1滴分分注します。懸濁液は毛細管現象によってカバーガラスの下に引き込まれます。1つ目の計数室を満たした後、2つ目の計数室を満たしてください。これで細胞の計数準備が整いました。細胞を数分間静置させます。また、細胞が沈殿した後、余分な液体を吸い取っておくと効果的です。100倍の倍率で顕微鏡によりスライドを観察してください。グリッドの中央にある大きな領域が確認できるはずであり、そこは3本の平行線で囲まれています。この中央領域内の細分区域も同様に3本の平行線で囲まれており、各細分区域は単線によって16個のより小さな正方形に分割されています。この領域内の細胞は、凝集することなく均等に分布している必要があります。細胞が均一に分布していない場合は、洗浄して再度装填してください。ヘモサイトメーターを用い、ハンドカウンターを使用して、4つの角の正方形および中央の正方形内の細胞をカウントします。正方形の上辺および左辺の3本線の中央線に接している細胞はカウントし、下辺または右辺の3本線の中央線に接している細胞はカウントしません。もう一方の計数室でも同様にカウントを繰り返します。細胞のカウントが完了したら、1 mLあたりの細胞数を算出できます。算出するには、1区画あたりの平均細胞数に希釈倍率と10,000を乗じて、サンプル中の細胞数を求めます。1 mLあたりの細胞数に、サンプルを採取した細胞懸濁液の全量を掛けます。これで、懸濁液の生存率を決定する準備が整いました。サンプル中の生存細胞数を決定するために、トリパンブルーを使用します。まず、0.5 mLの4%トリパンブルー、0.03 mLのHBSS、および0.1 mLの細胞懸濁液を小型チューブに合わせ、十分に混合します。ヘモサイトメーターにロードする前に、チューブを5分間静置させてください。生存細胞は無染色ですが、死細胞は血球計数器下で青色に見えます。全細胞数と生存細胞数（無染色の細胞）をカウントし、サンプル中の生存細胞率を算出してください。終了後、血球計数器のカバーガラスを70%エタノールで洗浄し、次に脱イオン水で洗浄して除染してください。自然乾燥させ、次回の使用まで保存してください。以上で、培養細胞の数と生存率を決定する方法についての説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。

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カウントと培養細胞の生存率の決定

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