哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

組織培養技術は、細胞生物学の分野で幅広い用途が見出されています。しかし、培養細胞を健康に保つためには、定期的なメンテナンスが必要です。細胞が共流暢さに達すると、細胞を亜培養または継代する必要があります。

これを怠ると、増殖が抑制され、最終的には細胞死につながります。このビデオでは、接着細胞株と浮遊細胞株の両方の組織培養細胞を維持する方法を示します。こんにちは、私はテネシー州東部の分子病理学研究所ネットワークにあるDr.LANの研究室に所属しているリッキーです。

今日は、懸濁液と接着細胞をパッケージングするための2つの技術を紹介したいと思います。セルのプレートを継ぎます。まず、60 mmのペトリ皿または5 milの組織培養培地が入った25 cm四方の組織培養フラスコで、流暢に増殖した一次培養から始めます。

まず、滅菌ピペットで一次培養物からすべての培地を取り除きます。次に、付着した細胞単層をカルシウムとマグネシウムを含まない37°CHBSSの少量で1〜2回洗浄します。次のステップで追加するトリプシン酵素の作用を阻害する可能性のある残留ウシ胎児血清を除去すること。

次に、付着細胞層を覆うように、十分な温かいトリプシンEDTA溶液を培養物に加えます。次に、プレートを摂氏37度の保温トレイに1〜2分間置くことができます。インキュベーション後、プレートの底を平らな面に軽くたたいて細胞を取り出します。

倒立顕微鏡で培養物をチェックし、細胞が丸められていること、つまり細胞が表面から分離していることを確認します。セルが十分に取り外されていない場合は、プレートをさらに1〜2分間温めトレイに戻します。スコープを覗いた後、皿を完全な培地ですすぎ、懸濁液を2ミルの完全な培地を含む15ミルの円錐形チューブにピペットで移します。

細胞をスピンダウンしてペレット化し、ペレットを完全な培地に再懸濁します。次に、適切に標識された新しいプレートのそれぞれに等量の細胞懸濁液を追加します。あるいは、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、所望の密度に希釈して、特定の数の細胞を各プレートに追加することもできます。

すべてのプレートにサブカルチャーの日付とパッセージ番号を必ずラベル付けしてください。細胞懸濁液を添加した後、新しい培養物ごとに1ミルの新鮮な培地を置きます。次に、加湿した摂氏37度の5%CO2インキュベーターでプレートをインキュベートします。

細胞を一晩インキュベートした後、プレートに新鮮な培地を加え、37度に戻します。プレートが合流点まで成長したら、この手順を繰り返してプレートを再度通過させ、必要に応じて継ぎ続けることができます。それでは、浮遊培養で細胞を継代する方法をご紹介します。

懸濁培養における細胞のパッケージングは、接着細胞よりも簡単です。懸濁培養物を包装する前に、細胞が懸濁液中で凝集して培地が汚れて見えるようになるまで、細胞を2〜3日ごとに給餌して維持する必要があります。フラスコが渦巻いているとき。

これを行うには、フラスコに落ち着いたものを邪魔しないように注意しながら、インキュベーターから浮遊細胞のフラスコを取り出します。無菌的に底をついて、フラスコから培地の約3分の1を取り出して廃棄し、摂氏37度の等量の予温培地と交換します。培地を交換した後、フラスコを回して、摂氏37度、CO2の5%にあるインキュベーターに戻します。

15ミル未満の場合は、フラスコ内の培地でフラスコを水平位置にインキュベートし、細胞と培地の接触を強化します。そうでなければ、培養物が供給されていない日にフラスコを垂直にインキュベートすることができます。フラットを渦巻いてセルを再懸濁してチェックします。

良好な代謝成長を示す培地の色の変化を必ず観察してください。培養物がコンフルエントになったら(1ミルあたり約250万個の細胞)、継代することができます。今回も、接着培養と浮遊培養の両方で培養細胞を継代する方法をお見せしました。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてすべての実験で頑張ってください。