トランスポートのための凍結、融解、およびパッケージング細胞
2008年7月2日
培養哺乳動物細胞は、細胞生物学の研究で広く使用されています。このビデオでは、細胞とどのように凍結ストックを回復するために凍結保存するために必要な基本的なスキルを説明します。
細胞培養は、幅広い研究および診断アプリケーションで利用されています。細胞の保存、細胞老化の回避、汚染リスクの低減、および遺伝的ドリフトの影響を最小限に抑えるために、将来の研究に向けて細胞株を保存することが望ましい場合があります。細胞株は、長期保存のために凍結保存することが可能です。
このビデオでは、単層および浮遊状態で培養した細胞の凍結保存方法と、再び増殖させるための融解方法について解説します。こんにちは。私はイーストテネシーにあるMolecular Pathology Laboratories NetworkのDr.LANの研究室にいるRickyです。今日は、長期保存のための細胞の凍結方法と、液体窒素からの融解方法について説明します。
ヒト接着細胞を凍結させるには、まずパッケージングの際と同様に、細胞をプレートから剥離させます。凍結保存には、対数増殖期にある細胞を使用するのが最適であることに留意してください。細胞が剥離し、血清または血清含有培地を加えてトリプシン反応を停止させた後、細胞懸濁液を滅菌遠心チューブに移し、2 mL加えます。
同一ソースの同一サブカルチャーから得られた3皿以上の血清含有完全培地細胞を、1本のチューブにまとめることができます。室温で300～350 Gで5分間、細胞を遠心分離します。遠心後、上清を除去し、ペレットを4 °Cの10 mLで再懸濁します。
完全培地に同量の4°Cの凍結保存液を加え、細胞を十分に混合した後、チューブを氷上に置いて細胞数をカウントします。ヘモサイトメーターを用い、ほぼコンフルエントになった25 cm²flaskから細胞を凍結させる場合は、凍結保存液で懸濁液をさらに希釈し、最終的な細胞濃度を100万個/mLまたは1000万個/mLに調整します。約3 mLの凍結保存液で再懸濁し、細胞懸濁液を1 mLずつラベル付きの2 mLクライオバイアルに分注します。
バイアルのキャップをしっかりと締めてください。バイアルを-80°Cフリーザーに1時間から一晩置いてから、液体窒素保存フリーザーに移します。浮遊培養細胞の凍結保存は、単層培養細胞の凍結保存と原理的に同様です。
主な違いは、浮遊培養では最初にトリプシン処理を行う必要がないことです。細胞懸濁液を遠心チューブに移し、室温で300～350 Gで10分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを4 °Cの凍結保存培地を用いて1 mLあたり100万～1,000万個の密度で再懸濁します。
次に、細胞懸濁液を1 mLずつクライオバイアルに移し、凍結させます。単層培養で行った方法と同様に、前章で説明した手順に従って凍結バイアルを融解し、回復させます。まず、液体窒素フリーザーから細胞バイアルを取り出し、直ちに37 °Cのウォーターバスに入れます。
培地が融解するまでバイアルを絶えず撹拌します。通常、これには60秒未満かかります。融解後、開封する前にバイアルの上部を70% ethanolで拭き取ります。その後、融解した細胞懸濁液を、2 mLの温めた完全培地と20% fetal bovine serumを含む滅菌遠心チューブに移し、遠心分離を行います。
室温にて 150 to 200 Gs で 10 分間遠心分離します。この工程により、遠心分離後の残留 DMSO が除去されます。上清を捨て、細胞ペレットを 1 mL 程度の少量の完全培地（20% FBS 含有）で緩やかに再懸濁させます。これを、適切な量の培地が入った適切にラベル付けされた培養プレートに移します。一般的に、5 to 20 mL の培地に対して 1 mL の細胞懸濁液が必要となります。
次に、細胞を37°Cのインキュベーターに入れ、24時間培養します。5〜7日後、あるいは培地中のpH指示薬の色が変化した時点で、細胞がプレートに接着していることを確認し、培地を交換してください。細胞株が再構築されるまで、培養物は20% FBSを含む培地で維持してください。
回収率が極めて低い場合、元の培養物のうち一部のサブポピュレーションのみが増殖している可能性があります。モザイク状であることが知られている細胞株を扱う際は、特に注意してください。培養物を輸送する必要がある場合、単層培養と浮遊培養のどちらでも容易に行うことができます。
25 cmの組織培養フラスコ内で、細胞を単層でほぼコンフルエントになるまで、または懸濁状態で目的の密度まで増殖させます。単層培養の場合、まず培地を除去し、次にフラスコに新鮮な培地を満たします。輸送中にフラスコが反転した場合に細胞が乾燥するのを防ぐため、フラスコに培地を完全に満たすことが不可欠です。
懸濁培養の場合、新鮮な培地を加えてフラスコを満たします。キャップを締め、パラフィルムで固定します。その後、液漏れを防ぐために、漏出防止仕様のプラスチック袋またはその他の漏出防止容器にフラスコを密封します。
フラスコが破損した場合に備え、一次容器は二次断熱容器に入れられ、輸送中の極端な温度変化から保護されます。パッケージの外側には生物学的危険物ラベルを貼付します。通常、培養物は当日夜間配送または翌日配送の宅配便で輸送されます。
以上で、接着細胞および浮遊細胞の両方におけるヒト細胞培養の凍結および融解方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このビデオでは、培養した哺乳類細胞の凍結および保存、ならびに凍結ストックからの回収に関する不可欠な手法を実演します。適切な細胞保存は、将来の研究に向けて細胞株を維持するために極めて重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 細胞培養技術
- 細胞保存
背景
- 培養哺乳類細胞は研究において広く利用されています。
- 細胞を凍結保存することで、細胞老化やコンタミネーションを防ぐことができます。
- 細胞株の長期保存は、将来の実験において不可欠です。
- 凍結細胞を復元させるには、適切な融解技術が必要です。
研究目的
- 長期保存のための細胞凍結プロセスの実演。
- その後の培養に向けた凍結細胞の融解方法の解説。
- 細胞培養に従事する研究者に必要な実践的スキルの提供。
使用方法
- 単層および浮遊状態で培養した細胞の凍結。
- 長期保存のための液体窒素の使用。
- 凍結細胞を回復させるための融解手順。
- 実験室環境における技術の実演。
主な結果
- 哺乳類細胞の凍結および保存の成功。
- 効果的な融解技術の提示。
- 融解後の細胞生存率の維持。
- 細胞保存における一般的な失敗を避けるためのガイダンス。
結論
- 凍結および融解の手法は、細胞培養において極めて重要です。
- 適切な手法を用いることで、細胞株の寿命を延ばすことができます。
- これらのスキルは、細胞生物学の研究者にとって不可欠な基礎となります。
よくある質問
産業界における重要性
信頼性の高い細胞の保存と回収は、一貫性のある前臨床モデルを維持し、標的バリデーションおよびアッセイ開発ワークフローにおける再現性を確保するための基盤となります。適切な凍結保存により、遺伝的ドリフトやコンタミネーションのリスクを最小限に抑え、トランスレーショナルリサーチのための細胞株の長期的な完全性を維持できます。これらの手法により、探索および前臨床段階におけるスケーラブルで標準化された細胞調達が可能となり、メカニズム研究やリード化合物同定における変動を低減できます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 標的への結合およびパスウェイ解析の一貫性を確保するため、遺伝的に安定した細胞株の保存を可能にする。
- 運用の価値： 頻繁な継代の必要性を減らし、表現型のドリフトと実験的なばらつきを最小限に抑える。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 再現性のあるハイスループットスクリーニングおよびアッセイ適格性評価のために、継代数の少ない再生可能な細胞ストックを提供します。
- 運用上の価値： 細胞ベースのアッセイにおけるバッチ間の整合性をサポートし、スクリーニングキャンペーン全体でのデータの信頼性を向上させます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 創薬から前臨床検証に至るまで、疾患関連細胞モデルの継続性を確保する。
- 運用的価値： チームや拠点間での標準化された細胞分譲を促進し、部門横断的な連携を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
細胞の凍結保存は、標的バリデーション、アッセイ開発、および前臨床試験において信頼性の高い細胞供給を可能にし、各段階におけるモデルの一貫性を確保することで、創薬の連続的なプロセスに組み込まれています。
- 探索生物学：ターゲットの検証およびパスウェイの解明に向けた、安定し、十分に特性解析された細胞株を提供することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある化合物スクリーニングに適した、標準化され汚染のない細胞ストックを通じて、アッセイ準備を可能にします。
- アナリティクス：定量的で一貫した細胞入力を提供し、用量反応および生存率の読み取り値における信頼性を向上させます。
- トランスレーショナルリサーチ：初期探索から前臨床研究までモデルの忠実性を維持し、リード化における生物学的リスクを低減します。
- エンタープライズでの再利用：再利用可能な中央集中型の細胞バンク機能を確立し、プロジェクトや地域をまたいだ細胞調達の標準化を図ります。
運用および企業への影響
- 科学的価値：遺伝的ドリフトを最小限に抑え、細胞ベースのアッセイにおける表現型の整合性を確保することで、予測の信頼性を高めます。
- 運用上の価値：凍結、融解、およびパッケージングのプロトコルを標準化することにより、再現性と拡張性を向上させます。
- 戦略的価値：信頼性の高い前臨床モデルと一貫した生物学的アウトプットを確保することで、後期段階における失敗のリスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットバリデーションおよびリード最適化のための信頼できる細胞システムを提供し、リスク調整後の意思決定を可能にします。
実施上の考慮事項
- 細胞の生存率を維持するため、無菌操作および凍結保護剤の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- プログラムフリーザー（徐冷装置）および液体窒素保存設備へのアクセスが不可欠です。
- 一貫した細胞回収率を確保するため、チーム間で標準作業手順書（SOP）を共通化する必要があります。
- 細胞種や増殖特性に応じて、凍結媒体および細胞密度の最適化が必要です。
- 細胞株の凍結保護剤への感受性や凍結・融解ストレスによる制限があり、回収効率に影響を及ぼす可能性があります。
