Name: 骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶマウス骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞を培養分化させる方法。Toll様受容体リガンドを用いたin vitro培養とフローサイトメトリーによる形態・IL-12産生解析を含む免疫学研究手法です。

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JBは、自然科学と工学研究評議会（NSERC）からstudentshipsによってサポートされています。このプロジェクトのサポートは、グラントはMOP - 67066、カナダ衛生研究所によって提供されています。

このプロトコルは、ルッツらから採用されています1。 骨髄の収穫と加工<ol><li> 脛骨と大腿骨の分離：ドナーマウスを安楽死させると70％エタノールで足をスプレー。鈍鉗子でしっかりと第一足首をつかんで、皮膚と脛骨を露出するために、基になる筋肉を切り取るために始める。骨の損傷を避けるために、膝関節はそのままに残し、脛骨にゆっくりと平行にカット。 大腿骨をきれいにするには、鈍鉗子でつかんで膝関節を固定化する。鋭いはさみと湾曲したピンセットで筋肉組織を離れて清掃してください。股関節が露出しているとハサミが大腿骨頭と股関節の間に配置できるようになるまで上昇を続けます。リン酸塩に大腿骨と股関節と場所との間で切断して骨を削除することは氷の上に緩衝食塩水（PBS）。 </li><li> 骨髄の除去：はさみと曲がったピンセットを用いて骨からクリーン残りの筋組織。各骨の骨端を切断し、中央の空洞を探します。 PBSでロードされた10mLの注射器と25G0.5&quot;針を使用して、非組織コーティングしたシャーレに骨髄をフラッシュします。 </li><li> 骨髄の処理：単一細胞懸濁液（動きをスクレーピングして、上下に使用する）に骨髄を解離する1mLのシリンジからプランジャーのゴムの端を使用してください。円錐形のファルコンチューブに骨髄を収集し、そしてPBSで残留骨髄をすすぐ。 </li></ol>樹状細胞の培養<ol><li>血球計（図1）上にDCメディアとカウントDC前駆体の細胞を再懸濁します。あなたは、さまざまなサイズのセルが表示されます、DCの前駆体は、最大かつ最も明るいです。差のみこれらの細胞をカウント。 two大腿骨及び野生型のC57BL / 6マウス（6-8週齢）の二つ脛骨から、25〜40 × 10 6合計のDC前駆体との間で考えてください。 <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> 図1 </li><li> 40 ng / mLの組換えマウスGM - CSFを添加したDCのメディアで2 × 10 5 DC前駆体/ mlの密度で培養細胞。非組織でコーティングされたポリスチレンのペトリ皿に細胞をプレート。 </li></ol>メディアを追加（3日​​目） メディアを更新するには、40 ng / mLのGM - CSFを添加した新鮮な培地の総容積の半分を追加します。 つのメディアの第三（6日目）と成熟を交換してくださいメディアを更新するには、慎重にメディアの総量の3分の1を削除し、文化の6日目で40 ng / mLのGM - CSFを添加した新鮮なDCのメディアでこのボリュームを交換してください。 必要に応じて、樹状細胞は、サイトカインやToll様受容体リガンドを用いて成熟のために刺激することができる。ビデオでは、樹状細胞を5 ng / mLののCpGで一晩刺激により成熟された。 樹状細胞の収穫 DCの文化は完了です（図2）。細胞は懸濁液中に、疎プレートに付着の両方になります。付着した細胞は、組織培養スクレーパーで皿をこすると、PBSで洗浄して除去することができます。細胞の総数は、一週間の文化と分化期間中に5〜8倍に増加する、従って、1から1.6 × 10 6細胞/ mLを収穫する予定。 <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="図2" width="407" height="358" /> 図2 試薬<ol><li> DCメディア <ol><li>を補充したRPMI - 1640培地、： </li><li> 10％ウシ胎児血清</li><li> 100 IU / mLのペニシリン</li><li> 100μg/ mlのストレプトマイシン</li><li> 1％L -グルタミン</li><li> 0.1パーセント2 - メルカプトエタノール</li><li> 1X非必須アミノ酸</li><li> 1Xピルビン酸ナトリウム </li></ol></li><li> 組換えマウスGM - CSF <ol><li> rmGM - CSF（Peprotech社製株式会社、ニュージャージー州、カタログがない。315から03） </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

樹状細胞は自然免疫と獲得免疫の相互作用の研究に有用であり、ワクチンのベクトルとして用いることができる。このビデオでは、我々は、骨髄を​​分離し、in vitroで骨髄樹状細胞を区別するための手順を示している。培養期間に続いて、これらの細胞を顕微鏡の両方のような付着が多い樹状突起を持つ細胞と、非接着性円形細胞を可視化することができます。樹状細胞は、さらに抗原でパルスすることにより抗原提示のために操作したり、サイトカイン及び/またはToll様受容体リガンドを（総説については、ギルボア、2008（2）参照）を用いてサイトカイン産生と共刺激分子の発現上昇のために刺激することができる。

<table><tbody><tr><td>リコンビナントマウスGM-CSF</td><td>試薬</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

骨髄樹状細胞（DC）は頻繁に自然免疫と獲得免疫機構と感染症への早期対応との間の相互作用を研究するために使用されます。これらは、最も強力な抗原提示細胞であるため、DCがますます抗原特異的免疫応答の誘導を研究するためにワクチンのベクターとして使用されています。このビデオでは、我々はin vitroで骨髄と差別化樹状細胞を処理し、ドナーマウスから脛骨と大腿骨を採取するための手順を示しています。刺激後に樹状細胞の変化の性質：成熟DCは+ T細胞のCD4 +とCD8を持つ抗原提示と相互作用することが可能であるのに対し、未成熟樹状細胞は、強力な食細胞である。機能活性の変化は、細胞表面マーカーやサイトカイン産生のアップレギュレーションに対応しています。多数のエージェントは、サイトカインとToll様受容体リガンドを含む成熟DC、するために使用することができます。このビデオでは、我々は、CpGまたはモック治療で一晩刺激後に、二つの共刺激分子、CD86とCD40、およびサイトカイン、IL - 12の発現のフローサイトメトリーの比較を示す。分化した後、樹状細胞は、さらにワクチンのベクトルとして使用するために操作することができるまたはin vitroでのペプチドまたはタンパク質を用いてパルスする抗原特異的免疫応答を生成する、または組換えウイルスベクターを用いた形質導入。

このビデオでは、マウスの骨髄から骨髄樹状細胞を区別するための手順を示しています。マウス脛骨と大腿骨、および骨髄の処理の分離が実証されています。細胞の表現型とのCpGを用いてIL - 12産生は、次の成熟を描いた分化する前と後の細胞形態を示す写真、および数値は示されている。

骨髄系樹状細胞（DC）は、自然免疫と獲得免疫のメカニズム間の相互作用や、～に対する初期応答を研究するために頻繁に用いられています。

私の名前はJeanette Boudreauxです。本日は、骨髄前駆細胞から骨髄系樹状細胞を培養する手順をご説明します。骨髄系DC系は、自然免疫と獲得免疫の相互作用に関する研究において重要性が高まっており、ワクチン開発のプラットフォームとしても利用が拡大しています。今回は、前駆細胞を単離し、培養に供し、それらを樹状細胞へと分化させるステップを解説します。その後、成熟前後の細胞のフローサイトメトリー分析について説明します。Toll様受容体リガンドを用いることで、培養期間中に細胞がin vitroで増殖するため、0日目に播種した前駆細胞と比較して、総細胞数が約5倍から8倍に増加することが予想されます。本日の手順はオープンベンチで実演しますが、無菌状態を維持するため、培養操作は生物学的安全キャビネットまたは層流クリーンベンチ内で行うことを推奨します。まず、PBSを満たした25ゲージの針付き10 mLシリンジ、曲鉗子1組、直鉗子1組、鋭視剪刀、および骨の切断に使用可能な鈍視剪刀を用意します。ドナーマウスを安楽死させた後、脚部に70%エタノールをスプレーして切開の準備をします。鈍視剪刀でマウスの足首をしっかりと固定し、鋭視剪刀を用いて脚部の皮膚と筋肉組織を慎重に切り取りました。アキレス腱から切り始め、骨を傷つけないように注意しながら、脚の後面から皮膚を取り除きます。次に、脚の前部から皮膚と筋肉を切り除きます。この手順の後、脚の深層筋肉組織が露出しているはずです。湾曲鉗子の一方のアームを脛骨と残りの筋肉の間に滑り込ませて、それらを結合している結合組織を切り離し、鋭い剪刀で腱を切断して、除去する筋肉を両端から切り離します。骨が露出し、筋肉組織が残らなくなるまで、このように脛骨から筋肉を掃除し続けます。大腿骨を掃除するには、鈍端鉗子で膝関節を掴み、曲鉗子を用いて再び周囲の筋肉組織を剥がします。骨を傷つけないように注意しながら、残っている筋肉を鋏で切り取り除去します。大腿骨頭が股関節内で完全に見えるまで、筋肉組織の除去を続けます。骨剪刀を大腿骨に沿って滑らせ、大転子を越えて股関節内に挿入します。一度しっかりと切断して骨を切り離し、氷上のPBSに入れます。多くの樹状細胞が必要な場合は、もう一方の後肢からも採取することができます。骨髄を取り出す際は、骨の両端に筋肉組織が残っていないことを確認してください。その後、骨剪定鋏を用いて、膝関節の骨を切り離します。次に、1本目の骨の骨端を切り落とします。針先を骨の中心に挿入し、シリンジのプランジャーを強く押し、骨髄を清潔なディッシュに押し出します。骨髄が完全に洗い出されたことが確認できるまでこの操作を続け、残りの骨についても同様に繰り返します。1milシリンジのプランジャーのゴム端を用いて、上下に押し潰すようにして骨髄を優しく解離させ、単

culture-of-myeloid-dendritic-cells-from-bone-marrow-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

樹状細胞による二次リンパ器官における抗原提示がT細胞媒介免疫応答の開始に重要です。ここでは、マウス樹状細胞を骨髄由来の文化、活性化、および2光子イメージングのための標識を示す。...

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

このビデオは、成体マウスの骨髄から樹状細胞(T細胞を活性化する主要な抗原提示細胞)を生成するためのプロトコルを説明しています。...

骨髄由来樹状細胞の作製:マウス骨髄から樹状細胞を作製する方法

このビデオは、一般的なリンパ系前駆細胞(CLP)から形質細胞様樹状細胞(pDC)を生成するin...

一般的なリンパ系前駆細胞からの形質細胞様樹状細胞のin vitro作製

未成熟樹状細胞は、免疫と耐性のバランスを調整するために、寛容性または成熟性樹状細胞に選択的に分化させることができます。この研究は、未熟な単球由来樹状細胞(moDC)、代謝表現型が異なるin...

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)で培養した骨髄細胞は、マクロファージと樹状細胞(DC)を含む不均一な培養を生成します。この方法は、GM-CSF培養中のマクロファージとDCを区別するために、MHCIIとHA(HA)結合を使用することを強調している。この培養物のマクロファージは、肺胞マクロファージと多くの類似点があります。...

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

ここでは、ヒトの抗凝固血液の密度勾配遠心分離後に、末梢血単核細胞からの磁気ビーズ分離によって単球がどのように単球を単離されるかを示します。5日間のインキュベーション後、ヒト単球は未成熟樹状細胞に分化し、非臨床環境での実験手順の準備が整います。...

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115...

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

本プロトコールは、マウスからの骨髄由来マクロファージの単離および培養について記載している。...

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

ここでは、Echinococcus granulosusからのin...

Echinococcus granulosusからの小さな細胞外小胞の単離と樹状細胞の取り込み

学ぶマウス骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞を培養分化させる方法。Toll様受容体リガンドを用いたin vitro培養とフローサイトメトリーによる形態・IL-12産生解析を含む免疫学研究手法です。

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

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