Name: 光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: 学ぶタイガーサラマンダーの網膜スライスを用いたパッチクランプ記録法。視覚刺激下での興奮性シナプス電流の測定手法を解説し、網膜生理学と視覚情報処理の研究に応用できる技術を紹介します。

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ソリューション<ul><li>神経節細胞の細胞内溶液（mMで）：100 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、1 EGTA、10 HEPES、4 ATP、0.5 GTP、90μMスルホローダミンBの（染色用）、でpH = 7.4に調整KOH </li><li> 90 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、10 BAPTA、10 HEPES、4 ATP、0.5でpH = 7.4に調整GTP、90μMスルホローダミンB（染色用）、：双極細胞（mMで）のための細胞内液KOH </li><li>細胞外リンゲル溶液（mMで）：112塩化ナトリウム、5グルコース、5 HEPES、NaOHでpH = 7.75に調整2のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、。ソリューションの酸素化は必要ありません。 </li></ul>録音室を準備する私たちの記録室は、よく別の接着剤から切り出された小さなシリコンブロックは組織切片のために安定性を提供するために配置されるだけでなく接着剤付き顕微鏡のスライドで構成されています。 網膜スライスの準備光受容体の漂白を避けるために、郭清は、IRまたは暗赤色灯の光で行われる。一方が棒の経路からの応答を記録に興味を持っている場合は、唯一の赤外光は、（IRは、顕微鏡となく、部屋の明かりを解剖。追加の赤外線ゴーグルが顕微鏡下で行われない手続きのために使用される）を使用する必要があります。一、主に記録のコーンの光の応答に興味を持っている場合は、薄暗い赤い部屋の光または赤色閃光灯を使用することができます。顕微鏡は、しかし、それでもIR接眼レンズが必要です。 光受容体の入力が実験には無関係である場合、プロシージャは通常の顕微鏡を使用して、通常の室内光で行うことができる。 <ol><li>よく接着剤、シリコーンを持つ2つの顕微鏡スライドを準備してください（フィルタをプッシュ各スライド上にシリコーングリースの二つの平行なバンド（約0.5センチメートル離れて）を作成し、スライドの片側にフィルター長方形の紙を置いて、両方のグリースバンド交差それがうまくスライドにアタッチされるようにカミソリの刃の部分と紙） </li><li>動物はその後、断頭し、ダブルpithed、30分間氷浴中に置かれている：確立されたプロトコルに従ってサンショウウオを生け贄に捧げる。 </li><li>サンショウウオの頭から目を削除し、氷冷リンゲル液で湿らせたティッシュの紙の上に解剖顕微鏡下に置く</li><li>目から結合組織を取り除く</li><li>角膜に小さなカットをするためにカミソリの刃を使用して、 </li><li>目にその添付ファイルに沿ってハサミでそれを除去しながら鉗子で角膜を切るホールド</li><li>鉗子でレンズを取り外す</li><li>鉗子で虹彩を持ち、虹彩を削除するには、鋸状縁に沿って切断</li><li>二つの長方形の部分にアイカップを切る</li><li> （非常に慎重に押し下げながら、ピースを平らに確認してください）​​作品の一つをピックアップし、ろ紙上強膜側を上に置きます</li><li>静かに今ファイラ紙に添付すべき、網膜から強膜を持ち上げ</li><li>すぐに良くするために、氷冷リンゲル液を追加する</li><li>番目の部分に同じことを繰り返します。 </li><li> 200 -300μmの広いスライスをカットする特注のスライサーに配置されたカミソリの刃を使用してください。 </li><li>フィルター紙の側でスライスをピックアップしてピンセットを使用して、網膜の層が見えるようになるので、それを裏返し、真空グリースバンドの上に置きます</li><li>無傷に見える一は、いくつかのレイヤーを認識できる場合（倍率が充分ではないとして層は解剖顕微鏡下で確認することが困難である、しかし、スライスは通常、十分である網膜の層を示す水平バンドを表示するスライスを選択してください。それは）正立顕微鏡下で観察されると、スライスを使用するかどうかの最終決定は、しかし、行われる。つのスライドの間に呼び出し音のブリッジを構築することにより、記録のチャンバースライドに移動</li><li>スライスが傾いていないようにろ紙が録音室でゴムブロックに押し付けていることを確認してください（神経節細胞と光受容器が同時に焦点が合うはず） </li></ol>レコーディング機器で組織を配置する<ol><li>記録のスライドは、顕微鏡下に置き、重力の灌流systeを通じてリンゲルソリューションで灌流され</li><li>準備は10倍と40倍の水浸対物レンズと正立顕微鏡で可視化です。 </li><li>再び、我々は唯一の光受容体の漂白を防ぐために赤外光を使用してください。赤外線カメラは、テレビ画面に接続されている顕微鏡のサイドポートに接続されている。 </li></ol>視覚刺激視覚刺激はPsychtoolboxを使用して、MATLABでプログラミングされており、顕微鏡画像インジェクタ（MBFバイオサイエンス）を用いて顕微鏡の最上位ポートを介して網膜上に投影されています。ビット+ +デジタルビデオプロセッサ（ケンブリッジリサーチシステム）は、14ビット輝度のスケールを取得してsynchrにするために使用されますデータ収集と刺激プレゼンテーションをonize。このビデオで使用される視覚刺激は、安定した一様な背景（上2秒のために提示された100％のコントラストの明るいまたは暗いバー（幅=460μm）であり、輝度= 8 * 10 4光子/μm/ sの、サイズ：1.84 X 1.38ミリメートル）。 電気生理学<ul><li>マイクロピペットプラーで：パッチ電極は、ホウケイ酸ガラス（1.5mmのID 84ミリメ​​ートル。。OD）から抜き出されます。神経節細胞の場合、抵抗値は2〜4 Mohmをです。双極細胞の場合、4と8 Mohmを間に高い抵抗値が使用されます。 </li><li>電圧クランプ記録はMulticlamp 700A（Molecular Devices社）、アンプとLabVIEWでプログラミングされた研究室内部のソフトウェアを使用して実行されます。 </li><li>薬は、8チャンネルの灌流システムを介して灌流されています。 microperfusion電極は、スライス（あなたが血流をオンとオフ、1つのニーズが、プレッシャーはスライスがろ紙から切り離さになることができるように強すぎではないことに注意するときに組織が目に見えて移動する必要があります）の近くに配置されています。実験中にmicroperfusionは絶えず記録は血流のオンとオフを切り替えることによって邪魔されないように（何の薬が必要ない場合は、コントロールのソリューションを灌流する）オンにする必要があります。 </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

利点： <ol><li>すべての細胞型は、アクセス可能です </li><li>細胞型の簡単な識別は、特に、蛍光色素は、電極の溶液に添加されている場合 </li><li>薬理学的作用物質は、容易に標的細胞に到達することができます </li><li>パッチクランプ法は、網膜の計算では異なるイオンチャネルの役割を調査することができます。同じ情報が鋭い電極と細胞外スパイクの録音または録画を介して取得することができます。 </li><li>この手法は、他の動物モデルに適用することができます。 </li></ol>短所： <ol><li>プロセスは、スライスの過程で切断されてしまうかもしれません。したがって、空間的な受容野に焦点を当てる研究が困難な場合があります。 </li><li>電気生理学のために使用されるvitro標本におけるほとんどの網膜のように、色素上皮は、光受容体の漂白につながることが、削除されます。高い光強度で刺激を必要とする、または多くの適応状態の下で網膜を勉強する必要がある研究は、この手法で困難に陥ることがあります。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>パッチクランプアンプ</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>正立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td>40xおよび10x水浸対物レンズ、蛍光フィルター、水銀ランプ搭載</td></tr><tr><td>P-97</td><td>マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>顕微鏡像インジェクター</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-channel perfusion system</td><td>マイクロ灌流システム</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>デジタルビデオプロセッサー</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared Oculars</td><td>その他</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive silicone wells</td><td>その他</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>直径20mm、深さ1.0mm</td></tr><tr><td>Membrane Filters</td><td>フィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>電極用ガラス</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters</td><td>フィルター</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4mmフィルター、.2umナイロンメンブレン、ポリプロピレン製ハウジング</td></tr><tr><td>IR camera</td><td>顕微鏡搭載カメラ</td><td>ソニー株式会社</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7Wビデオカメラ</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole-4-acetic acid sodium salt</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larval tiger salamanders</td><td>動物</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

我々は、シナプス回路が網膜の基礎となる視覚情報の処理を研究するためにホールセルパッチクランプ法を使用してください。このビデオでは、我々は、網膜のスライス標本における個々のセルの光誘発電流の全細胞記録を実行するプロセスをガイドします。我々は、動物モデルとして水生トラフサンショウウオを使用してください。我々は目の解剖を記述することで開始し、スライスを電気生理学的記録のためにマウントする方法を示します。スライスが録音室に配置されると、我々は、ホールセル電圧クランプ記録を実行する方法を示します。我々は、その後、光誘発電流応答を引き出すためにスライスに光受容体の上に視覚刺激を投影。録音中に我々は、8チャンネルの灌流システムは、私たちはすぐに別のエージェントを切り替えることができることにより、薬理学的薬剤とスライスを灌流。網膜スライス標本は広く、特にホールマウントの準備にはアクセスできないアマクリンまたは双​​極細胞を、研究するために、網膜でのパッチクランプ記録のために使用されます。

このビデオでは、水生トラフサンショウウオの網膜スライスにおけるホールセル電圧クランプ記録のプロセスを示しています。網膜の視覚刺激時のパッチクランプ記録を実行する方法を我々は、だけでなく、スライスの準備を示しています。

私たちは、網膜における視覚情報処理の基盤となるシナプス回路を研究するために、ホールセルパッチクランプ法を用いています。このビデオでは、……

本日は、パッチクランプ記録用のタイガサラマンダー網膜切片の作製方法について説明します。まず、2種類の顕微鏡スライドを準備します。ここでは、流体チャンバーとして使用するため、接着性のウェルが付いたスライドを使用します。1枚目のスライドガラス上に、真空グリースの帯を2本平行に塗布します。次に、フィルターペーパーを光の帯に合わせて長方形に切り分けます。切り分けたピースの1つをグリースのレールの上に置き、スライドガラスにしっかり密着するように押し付けます。もう一方のパーツでも同様の操作を行います。2種類目のスライドには、小さなゴムブロックが接着されています。ここでは、ブロックの間に真空グリスを少量塗布します。また、組織スライサーに新しいカミソリの刃を装着します。最後に、解剖に使用する器具を準備します。具体的には、ピンセット2本、はさみ1本、および光誘発電流を記録するために頭部から眼球を取り出すための器具です。本来、解剖は赤外線（IR）光の下で行うべきですが、デモンストレーションのため、今回は明光下で作業します。まず眼球を取り出し、氷冷したリンゲル液で湿らせたティッシュペーパーの上に置き、顕微鏡で観察します。その後、眼球に損傷を与えないよう、余分な結合組織を取り除きます。常に表面に沿って切除します。これが顕微鏡から見える様子です。次に、カミソリの刃を用いて角膜に小さな切開を加えます。その際、ピンセットで眼球を固定しながら、カミソリの刃先を角膜に押し付けます。その後、ピンセットで角膜を保持し、はさみで水晶体を取り出します。ピンセットでレンズに容易にアクセスできるよう、アイカップの端に軽く圧力をかけます。次に、虹彩を取り除きます。ピンセットで虹彩を保持しながら、アイカップのみが残るまで鋸歯縁（aura serata）に沿って切開します。次に、I cupを2つの長方形に切断します。まず半分に切り、その後、上下の端をトリミングします。あらかじめ準備しておいたスライドの一枚を取り、I cupの断片を一つ拾い上げ、網膜側を下にしてフィルターペーパーの上に置きます。次に、この強膜を引き上げ、スライド上に網膜だけが残るようにします。その後、迅速に溶液をチャンバーに加えます。2つ目の網膜組織についても、同様の手順を繰り返します。しかし今回は、フィルターペーパーの上に網膜を置く際に顕微鏡で観察しながら行うことができます。左手のピンセットを用いて、強膜を慎重に押し下げます。最後に、網膜を200から300 µm幅のスライスに切断します。次に、実験に使用する切片を選択します。適切な切片を選ぶために、切片を90度回転させて網膜の層を確認できるようにします。損傷がなく、異なる層を示す明確な水平帯が見られる切片を選択します。スライスを一方の容器から別の容器へ移動させるために、リンガー液のブリッジを作成し、スライスを溶液中で慎重に移動させます。スライスを配置する際は、フィルターペーパーがガラスに対して垂直になるように、ラバーブロックに押し当てます。これでパッチクランプ記録の準備が整いました。細胞内液は、1日に必要な量だけを解凍できるよう、少量ずつに分けて冷凍庫で保存します。電極に充填する前に、電極先端の詰まりの原因となる微小粒子を取り除くため、溶液をろ過します。神経節細胞からの記録には、ホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出したパッチ電極を使用します。電極抵抗が2～4 MΩになる設定を選択します。電極を充填する際は、電極先端に気泡が入っていないことを確認してください。指でガラスを軽く弾くと、気泡を除去しやすくなります。これはヘッドステージに取り付けられた電極ホルダーです。電極ローラーには塩化銀線が含まれています。こちらは、アガールブリッジを備えた接地電極です。こちらが灌流ピペットです。これは8チャンネルのマイクロ灌流システムに接続されています。メインの灌流は重力駆動で行われるため、溶液を満たしたボトルを設置し、チューブを通って記録室へ溶液が滴下する仕組みになっています。暗所での記録を可能にするため、顕微鏡のサイドポートにTV画面に接続されたIRカメラを取り付けています。トップポートには、網膜に視覚刺激を投影するためのイメージプロジェクターを接続しました。そして最後に、パッチクランプアンプを接続します。次に、網膜スライスを顕微鏡下に設置し、浴槽にアース電極を加えてメインの灌流系を構築します。続いて、重力灌流システムからのチューブを導入します。反対側のガラス管は真空吸引装置に接続されており、これにより液面が一定に保たれます。また、サクションチューブが電気ショルダーに接続されていることを確認します。次に、マイクロ灌流ピペットを配置します。これをバスの中に、顕微鏡対物レンズに続いて下げます。スライスに近づいたら、溶液がスライスに当たるように少しだけ引き戻します。灌流を開始すると、このようにスライスがわずかに動くのが確認できるはずです。それでは、記録に適した細胞を探しましょう。スライスの底部にある神経節細胞を探します。電極をバスに入れる前に準備を整え、陽圧をかけます。顕微鏡下で電極を確認したら、細胞にパッチクランプを行うため、スライスの直上まで電極を下降させます。対物レンズを40 xに切り替えました。次に、ベースライン電流をゼロにし、電極抵抗を確認します。シールテストでは、10 mVのパルスを10回連続で印加し、電極と細胞との間に強固なシールが形成されたかを確認します。次に、電極を標的細胞に向けて降ろします。細胞体にディンプル（くぼみ）が見えたら、チューブの正圧を解除して、密なシールを形成させます。これにより抵抗値が非常に高くなり、電流波形が平坦になります。小さなスパイク状の波形は電極による容量性アーチファクトです。これらは次のように補正することができ、これで除去されました。それでは、細胞内への侵入を試みます。そのため、電極ショルダーに接続されたチューブに慎重に小さな吸引パルスを加え、すべてが正しく機能すれば、電流波形がこのように変化するのがわかります。現在見えているスパイクは膜容量によるものであり、これについても補正が可能です。さて、この調製物は暗所で準備されたものです。光誘発反応を記録できるか確認してみましょう。オシロスコープに表示されている波形は、-60 mVで電位固定された神経節細胞の電流応答です。使用した光刺激は、均一で安定した背景上に提示される明暗のバーです。当研究室のソフトウェアにより、1回の試行の全記録が表示されています。これは、ダークバーの出現およびブライトバーの消失に応答するオフ細胞であることがわかります。上部の白線は刺激の持続時間を示しています。これで、さまざまな薬理学的薬剤を灌流させる実験を行うことができます。例えば、GABA作動性およびグリシン作動性の抑制を遮断することができます。1分未満待機すると、通常、ここで薬剤の効果が見え始めます。反応はより強く、より持続的になりました。網膜スライス標本の作製は、網膜内の異なる細胞からのシナプス電流を記録するために広く用いられており、電極溶液に蛍光色素を添加することで、細胞型を容易に確認することができます。解剖学的には、本手法では幼生TGAサンショウウオを動物モデルとして使用します。サンショウウオが変温動物であり、網膜細胞が大きいという事実は、記録条件において有利に働きますが、同様の技術を哺乳類の標本に適用することも可能です。

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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