Name: 光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: 学ぶタイガーサラマンダーの網膜スライスを用いたパッチクランプ記録法。視覚刺激下での興奮性シナプス電流の測定手法を解説し、網膜生理学と視覚情報処理の研究に応用できる技術を紹介します。

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ソリューション<ul><li>神経節細胞の細胞内溶液（mMで）：100 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、1 EGTA、10 HEPES、4 ATP、0.5 GTP、90μMスルホローダミンBの（染色用）、でpH = 7.4に調整KOH </li><li> 90 K -グルコン酸、8のKCl、1のMgCl 2、10 BAPTA、10 HEPES、4 ATP、0.5でpH = 7.4に調整GTP、90μMスルホローダミンB（染色用）、：双極細胞（mMで）のための細胞内液KOH </li><li>細胞外リンゲル溶液（mMで）：112塩化ナトリウム、5グルコース、5 HEPES、NaOHでpH = 7.75に調整2のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、。ソリューションの酸素化は必要ありません。 </li></ul>録音室を準備する私たちの記録室は、よく別の接着剤から切り出された小さなシリコンブロックは組織切片のために安定性を提供するために配置されるだけでなく接着剤付き顕微鏡のスライドで構成されています。 網膜スライスの準備光受容体の漂白を避けるために、郭清は、IRまたは暗赤色灯の光で行われる。一方が棒の経路からの応答を記録に興味を持っている場合は、唯一の赤外光は、（IRは、顕微鏡となく、部屋の明かりを解剖。追加の赤外線ゴーグルが顕微鏡下で行われない手続きのために使用される）を使用する必要があります。一、主に記録のコーンの光の応答に興味を持っている場合は、薄暗い赤い部屋の光または赤色閃光灯を使用することができます。顕微鏡は、しかし、それでもIR接眼レンズが必要です。 光受容体の入力が実験には無関係である場合、プロシージャは通常の顕微鏡を使用して、通常の室内光で行うことができる。 <ol><li>よく接着剤、シリコーンを持つ2つの顕微鏡スライドを準備してください（フィルタをプッシュ各スライド上にシリコーングリースの二つの平行なバンド（約0.5センチメートル離れて）を作成し、スライドの片側にフィルター長方形の紙を置いて、両方のグリースバンド交差それがうまくスライドにアタッチされるようにカミソリの刃の部分と紙） </li><li>動物はその後、断頭し、ダブルpithed、30分間氷浴中に置かれている：確立されたプロトコルに従ってサンショウウオを生け贄に捧げる。 </li><li>サンショウウオの頭から目を削除し、氷冷リンゲル液で湿らせたティッシュの紙の上に解剖顕微鏡下に置く</li><li>目から結合組織を取り除く</li><li>角膜に小さなカットをするためにカミソリの刃を使用して、 </li><li>目にその添付ファイルに沿ってハサミでそれを除去しながら鉗子で角膜を切るホールド</li><li>鉗子でレンズを取り外す</li><li>鉗子で虹彩を持ち、虹彩を削除するには、鋸状縁に沿って切断</li><li>二つの長方形の部分にアイカップを切る</li><li> （非常に慎重に押し下げながら、ピースを平らに確認してください）​​作品の一つをピックアップし、ろ紙上強膜側を上に置きます</li><li>静かに今ファイラ紙に添付すべき、網膜から強膜を持ち上げ</li><li>すぐに良くするために、氷冷リンゲル液を追加する</li><li>番目の部分に同じことを繰り返します。 </li><li> 200 -300μmの広いスライスをカットする特注のスライサーに配置されたカミソリの刃を使用してください。 </li><li>フィルター紙の側でスライスをピックアップしてピンセットを使用して、網膜の層が見えるようになるので、それを裏返し、真空グリースバンドの上に置きます</li><li>無傷に見える一は、いくつかのレイヤーを認識できる場合（倍率が充分ではないとして層は解剖顕微鏡下で確認することが困難である、しかし、スライスは通常、十分である網膜の層を示す水平バンドを表示するスライスを選択してください。それは）正立顕微鏡下で観察されると、スライスを使用するかどうかの最終決定は、しかし、行われる。つのスライドの間に呼び出し音のブリッジを構築することにより、記録のチャンバースライドに移動</li><li>スライスが傾いていないようにろ紙が録音室でゴムブロックに押し付けていることを確認してください（神経節細胞と光受容器が同時に焦点が合うはず） </li></ol>レコーディング機器で組織を配置する<ol><li>記録のスライドは、顕微鏡下に置き、重力の灌流systeを通じてリンゲルソリューションで灌流され</li><li>準備は10倍と40倍の水浸対物レンズと正立顕微鏡で可視化です。 </li><li>再び、我々は唯一の光受容体の漂白を防ぐために赤外光を使用してください。赤外線カメラは、テレビ画面に接続されている顕微鏡のサイドポートに接続されている。 </li></ol>視覚刺激視覚刺激はPsychtoolboxを使用して、MATLABでプログラミングされており、顕微鏡画像インジェクタ（MBFバイオサイエンス）を用いて顕微鏡の最上位ポートを介して網膜上に投影されています。ビット+ +デジタルビデオプロセッサ（ケンブリッジリサーチシステム）は、14ビット輝度のスケールを取得してsynchrにするために使用されますデータ収集と刺激プレゼンテーションをonize。このビデオで使用される視覚刺激は、安定した一様な背景（上2秒のために提示された100％のコントラストの明るいまたは暗いバー（幅=460μm）であり、輝度= 8 * 10 4光子/μm/ sの、サイズ：1.84 X 1.38ミリメートル）。 電気生理学<ul><li>マイクロピペットプラーで：パッチ電極は、ホウケイ酸ガラス（1.5mmのID 84ミリメ​​ートル。。OD）から抜き出されます。神経節細胞の場合、抵抗値は2〜4 Mohmをです。双極細胞の場合、4と8 Mohmを間に高い抵抗値が使用されます。 </li><li>電圧クランプ記録はMulticlamp 700A（Molecular Devices社）、アンプとLabVIEWでプログラミングされた研究室内部のソフトウェアを使用して実行されます。 </li><li>薬は、8チャンネルの灌流システムを介して灌流されています。 microperfusion電極は、スライス（あなたが血流をオンとオフ、1つのニーズが、プレッシャーはスライスがろ紙から切り離さになることができるように強すぎではないことに注意するときに組織が目に見えて移動する必要があります）の近くに配置されています。実験中にmicroperfusionは絶えず記録は血流のオンとオフを切り替えることによって邪魔されないように（何の薬が必要ない場合は、コントロールのソリューションを灌流する）オンにする必要があります。 </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

利点： <ol><li>すべての細胞型は、アクセス可能です </li><li>細胞型の簡単な識別は、特に、蛍光色素は、電極の溶液に添加されている場合 </li><li>薬理学的作用物質は、容易に標的細胞に到達することができます </li><li>パッチクランプ法は、網膜の計算では異なるイオンチャネルの役割を調査することができます。同じ情報が鋭い電極と細胞外スパイクの録音または録画を介して取得することができます。 </li><li>この手法は、他の動物モデルに適用することができます。 </li></ol>短所： <ol><li>プロセスは、スライスの過程で切断されてしまうかもしれません。したがって、空間的な受容野に焦点を当てる研究が困難な場合があります。 </li><li>電気生理学のために使用されるvitro標本におけるほとんどの網膜のように、色素上皮は、光受容体の漂白につながることが、削除されます。高い光強度で刺激を必要とする、または多くの適応状態の下で網膜を勉強する必要がある研究は、この手法で困難に陥ることがあります。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>パッチクランプアンプ</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>正立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td>40xおよび10x水浸対物レンズ、蛍光フィルター、水銀ランプ搭載</td></tr><tr><td>P-97</td><td>マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>顕微鏡像インジェクター</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-channel perfusion system</td><td>マイクロ灌流システム</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>デジタルビデオプロセッサー</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared Oculars</td><td>その他</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive silicone wells</td><td>その他</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>直径20mm、深さ1.0mm</td></tr><tr><td>Membrane Filters</td><td>フィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>電極用ガラス</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters</td><td>フィルター</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4mmフィルター、.2umナイロンメンブレン、ポリプロピレン製ハウジング</td></tr><tr><td>IR camera</td><td>顕微鏡搭載カメラ</td><td>ソニー株式会社</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7Wビデオカメラ</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole-4-acetic acid sodium salt</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larval tiger salamanders</td><td>動物</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

我々は、シナプス回路が網膜の基礎となる視覚情報の処理を研究するためにホールセルパッチクランプ法を使用してください。このビデオでは、我々は、網膜のスライス標本における個々のセルの光誘発電流の全細胞記録を実行するプロセスをガイドします。我々は、動物モデルとして水生トラフサンショウウオを使用してください。我々は目の解剖を記述することで開始し、スライスを電気生理学的記録のためにマウントする方法を示します。スライスが録音室に配置されると、我々は、ホールセル電圧クランプ記録を実行する方法を示します。我々は、その後、光誘発電流応答を引き出すためにスライスに光受容体の上に視覚刺激を投影。録音中に我々は、8チャンネルの灌流システムは、私たちはすぐに別のエージェントを切り替えることができることにより、薬理学的薬剤とスライスを灌流。網膜スライス標本は広く、特にホールマウントの準備にはアクセスできないアマクリンまたは双​​極細胞を、研究するために、網膜でのパッチクランプ記録のために使用されます。

このビデオでは、水生トラフサンショウウオの網膜スライスにおけるホールセル電圧クランプ記録のプロセスを示しています。網膜の視覚刺激時のパッチクランプ記録を実行する方法を我々は、だけでなく、スライスの準備を示しています。

私たちは、網膜における視覚情報処理の基盤となるシナプス回路を研究するために、ホールセルパッチクランプ法を用いています。このビデオでは、……

本日は、パッチクランプ記録用のタイガサラマンダー網膜切片の作製方法について説明します。まず、2種類の顕微鏡スライドを準備します。ここでは、流体チャンバーとして使用するため、接着性のウェルが付いたスライドを使用します。1枚目のスライドガラス上に、真空グリースの帯を2本平行に塗布します。次に、フィルターペーパーを光の帯に合わせて長方形に切り分けます。切り分けたピースの1つをグリースのレールの上に置き、スライドガラスにしっかり密着するように押し付けます。もう一方のパーツでも同様の操作を行います。2種類目のスライドには、小さなゴムブロックが接着されています。ここでは、ブロックの間に真空グリスを少量塗布します。また、組織スライサーに新しいカミソリの刃を装着します。最後に、解剖に使用する器具を準備します。具体的には、ピンセット2本、はさみ1本、および光誘発電流を記録するために頭部から眼球を取り出すための器具です。本来、解剖は赤外線（IR）光の下で行うべきですが、デモンストレーションのため、今回は明光下で作業します。まず眼球を取り出し、氷冷したリンゲル液で湿らせたティッシュペーパーの上に置き、顕微鏡で観察します。その後、眼球に損傷を与えないよう、余分な結合組織を取り除きます。常に表面に沿って切除します。これが顕微鏡から見える様子です。次に、カミソリの刃を用いて角膜に小さな切開を加えます。その際、ピンセットで眼球を固定しながら、カミソリの刃先を角膜に押し付けます。その後、ピンセットで角膜を保持し、はさみで水晶体を取り出します。ピンセットでレンズに容易にアクセスできるよう、アイカップの端に軽く圧力をかけます。次に、虹彩を取り除きます。ピンセットで虹彩を保持しながら、アイカップのみが残るまで鋸歯縁（aura serata）に沿って切開します。次に、I cupを2つの長方形に切断します。まず半分に切り、その後、上下の端をトリミングします。あらかじめ準備しておいたスライドの一枚を取り、I cupの断片を一つ拾い上げ、網膜側を下にしてフィルターペーパーの上に置きます。次に、この強膜を引き上げ、スライド上に網膜だけが残るようにします。その後、迅速に溶液をチャンバーに加えます。2つ目の網膜組織についても、同様の手順を繰り返します。しかし今回は、フィルターペーパーの上に網膜を置く際に顕微鏡で観察しながら行うことができます。左手のピンセットを用いて、強膜を慎重に押し下げます。最後に、網膜を200から300 µm幅のスライスに切断します。次に、実験に使用する切片を選択します。適切な切片を選ぶために、切片を90度回転させて網膜の層を確認できるようにします。損傷がなく、異なる層を示す明確な水平帯が見られる切片を選択します。スライスを一方の容器から別の容器へ移動させるために、リンガー液のブリッジを作

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、電気生理学的記録のためのマウスの網膜の暗順応のスライスを生成するための手順を説明します。...

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

この記事は、そのままマウスの網膜における蛍光標識神経集団から個々のセルの記録を示しています。二光子赤外線励起を使用してtransgenetically標識された細胞は、それらの光反応、受容野の特性、及び形態を研究するためのパッチクランプ記録を対象としていた。...

無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

このビデオでは、マウスの脳スライスにおけるレチノゲン酸シナプスとコルチコゲン酸シナプスの電気生理学的記録について説明しています。背側外側膝状核(dLGN)を含むスライスは、記録チャンバーに入れられます。刺激ピペットは、網膜神経節細胞(RGC)を刺激して網膜性シナプスを調査するための視路または皮質ニューロンを刺激して皮質性シナプスを調査するための視床網核のいずれかに配置されます。刺激を受けると、RGCと皮質ニューロンは興奮性神経伝達物質を放出し、LGNリレーニューロンにシナプス電流を生成します。これらの電流は、パッチクランプ記録ピペットを使用して記録されます。...

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ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

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電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

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脊椎動物の網膜の内核層ニューロンを研究するための改良されたフラットマウント調製としてのスプリット網膜

学ぶタイガーサラマンダーの網膜スライスを用いたパッチクランプ記録法。視覚刺激下での興奮性シナプス電流の測定手法を解説し、網膜生理学と視覚情報処理の研究に応用できる技術を紹介します。

光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

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