光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

本日は、パッチクランプ記録用のタイガサラマンダー網膜切片の作製方法について説明します。まず、2種類の顕微鏡スライドを準備します。ここでは、流体チャンバーとして使用するため、接着性のウェルが付いたスライドを使用します。

1枚目のスライドガラス上に、真空グリースの帯を2本平行に塗布します。次に、フィルターペーパーを光の帯に合わせて長方形に切り分けます。切り分けたピースの1つをグリースのレールの上に置き、スライドガラスにしっかり密着するように押し付けます。

もう一方のパーツでも同様の操作を行います。2種類目のスライドには、小さなゴムブロックが接着されています。ここでは、ブロックの間に真空グリスを少量塗布します。また、組織スライサーに新しいカミソリの刃を装着します。

最後に、解剖に使用する器具を準備します。具体的には、ピンセット2本、はさみ1本、および光誘発電流を記録するために頭部から眼球を取り出すための器具です。本来、解剖は赤外線（IR）光の下で行うべきですが、デモンストレーションのため、今回は明光下で作業します。まず眼球を取り出し、氷冷したリンゲル液で湿らせたティッシュペーパーの上に置き、顕微鏡で観察します。

その後、眼球に損傷を与えないよう、余分な結合組織を取り除きます。常に表面に沿って切除します。これが顕微鏡から見える様子です。

次に、カミソリの刃を用いて角膜に小さな切開を加えます。その際、ピンセットで眼球を固定しながら、カミソリの刃先を角膜に押し付けます。その後、ピンセットで角膜を保持し、はさみで水晶体を取り出します。

ピンセットでレンズに容易にアクセスできるよう、アイカップの端に軽く圧力をかけます。次に、虹彩を取り除きます。ピンセットで虹彩を保持しながら、アイカップのみが残るまで鋸歯縁（aura serata）に沿って切開します。

次に、I cupを2つの長方形に切断します。まず半分に切り、その後、上下の端をトリミングします。あらかじめ準備しておいたスライドの一枚を取り、I cupの断片を一つ拾い上げ、網膜側を下にしてフィルターペーパーの上に置きます。

次に、この強膜を引き上げ、スライド上に網膜だけが残るようにします。その後、迅速に溶液をチャンバーに加えます。2つ目の網膜組織についても、同様の手順を繰り返します。

しかし今回は、フィルターペーパーの上に網膜を置く際に顕微鏡で観察しながら行うことができます。左手のピンセットを用いて、強膜を慎重に押し下げます。最後に、網膜を200から300 µm幅のスライスに切断します。

次に、実験に使用する切片を選択します。適切な切片を選ぶために、切片を90度回転させて網膜の層を確認できるようにします。損傷がなく、異なる層を示す明確な水平帯が見られる切片を選択します。

スライスを一方の容器から別の容器へ移動させるために、リンガー液のブリッジを作成し、スライスを溶液中で慎重に移動させます。スライスを配置する際は、フィルターペーパーがガラスに対して垂直になるように、ラバーブロックに押し当てます。これでパッチクランプ記録の準備が整いました。

細胞内液は、1日に必要な量だけを解凍できるよう、少量ずつに分けて冷凍庫で保存します。電極に充填する前に、電極先端の詰まりの原因となる微小粒子を取り除くため、溶液をろ過します。神経節細胞からの記録には、ホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出したパッチ電極を使用します。

電極抵抗が2～4 MΩになる設定を選択します。電極を充填する際は、電極先端に気泡が入っていないことを確認してください。指でガラスを軽く弾くと、気泡を除去しやすくなります。

これはヘッドステージに取り付けられた電極ホルダーです。電極ローラーには塩化銀線が含まれています。こちらは、アガールブリッジを備えた接地電極です。

こちらが灌流ピペットです。これは8チャンネルのマイクロ灌流システムに接続されています。メインの灌流は重力駆動で行われるため、溶液を満たしたボトルを設置し、チューブを通って記録室へ溶液が滴下する仕組みになっています。

暗所での記録を可能にするため、顕微鏡のサイドポートにTV画面に接続されたIRカメラを取り付けています。トップポートには、網膜に視覚刺激を投影するためのイメージプロジェクターを接続しました。そして最後に、パッチクランプアンプを接続します。

次に、網膜スライスを顕微鏡下に設置し、浴槽にアース電極を加えてメインの灌流系を構築します。続いて、重力灌流システムからのチューブを導入します。反対側のガラス管は真空吸引装置に接続されており、これにより液面が一定に保たれます。

また、サクションチューブが電気ショルダーに接続されていることを確認します。次に、マイクロ灌流ピペットを配置します。これをバスの中に、顕微鏡対物レンズに続いて下げます。

スライスに近づいたら、溶液がスライスに当たるように少しだけ引き戻します。灌流を開始すると、このようにスライスがわずかに動くのが確認できるはずです。それでは、記録に適した細胞を探しましょう。

スライスの底部にある神経節細胞を探します。電極をバスに入れる前に準備を整え、陽圧をかけます。顕微鏡下で電極を確認したら、細胞にパッチクランプを行うため、スライスの直上まで電極を下降させます。

対物レンズを40 xに切り替えました。次に、ベースライン電流をゼロにし、電極抵抗を確認します。シールテストでは、10 mVのパルスを10回連続で印加し、電極と細胞との間に強固なシールが形成されたかを確認します。

次に、電極を標的細胞に向けて降ろします。細胞体にディンプル（くぼみ）が見えたら、チューブの正圧を解除して、密なシールを形成させます。これにより抵抗値が非常に高くなり、電流波形が平坦になります。

小さなスパイク状の波形は電極による容量性アーチファクトです。これらは次のように補正することができ、これで除去されました。それでは、細胞内への侵入を試みます。

そのため、電極ショルダーに接続されたチューブに慎重に小さな吸引パルスを加え、すべてが正しく機能すれば、電流波形がこのように変化するのがわかります。現在見えているスパイクは膜容量によるものであり、これについても補正が可能です。さて、この調製物は暗所で準備されたものです。光誘発反応を記録できるか確認してみましょう。

オシロスコープに表示されている波形は、-60 mVで電位固定された神経節細胞の電流応答です。使用した光刺激は、均一で安定した背景上に提示される明暗のバーです。当研究室のソフトウェアにより、1回の試行の全記録が表示されています。

これは、ダークバーの出現およびブライトバーの消失に応答するオフ細胞であることがわかります。上部の白線は刺激の持続時間を示しています。これで、さまざまな薬理学的薬剤を灌流させる実験を行うことができます。

例えば、GABA作動性およびグリシン作動性の抑制を遮断することができます。1分未満待機すると、通常、ここで薬剤の効果が見え始めます。反応はより強く、より持続的になりました。

網膜スライス標本の作製は、網膜内の異なる細胞からのシナプス電流を記録するために広く用いられており、電極溶液に蛍光色素を添加することで、細胞型を容易に確認することができます。解剖学的には、本手法では幼生TGAサンショウウオを動物モデルとして使用します。サンショウウオが変温動物であり、網膜細胞が大きいという事実は、記録条件において有利に働きますが、同様の技術を哺乳類の標本に適用することも可能です。