Name: ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-22T00:31:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法によるヒト胚性幹細胞の分化メカニズム解析。ホルムアルデヒド架橋、ソニケーション、抗体を用いた免疫沈降でタンパク質-DNA相互作用を解明し、幹細胞生物学の理解を深める。

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提出作品は、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）からFSへの助成金（RS1 - 00477から1）でサポートされています

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li>
<li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li>
</ol>

クロマチン免疫沈降（ChIP）は、細胞の分化に伴うクロマチンベースのプロセスの解剖のための貴重な技術を提供しています。この方法の成功のための前提条件は、良好な抗体と目的の抗原を欠いているコントロールの細胞または組織からクロマチンの可用性です。 DNAマイクロアレイ技術のチップを組み合わせることで、膨大な量の情報が得られる。 ChIPの結果の検証は、セルの開発中に生物学的プロセスの実行で、タンパク質修飾および/またはRNAをタンパク質の動的な関連付けをリンクさせることができる適切なテストシステムの可用性に依存します。

<table><tbody><tr><td>Proteinase-K</td><td>試薬</td><td>Roche Group</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNase-A</td><td>試薬</td><td>Fermentas</td><td>#EN0531</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37%</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>FX040-13</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>試薬</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>SA, fraction V</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>9410</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>試薬</td><td>JT Baker</td><td>4095-02</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>5910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>試薬</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>試薬</td><td>Applichem</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>試薬</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, プロテインA</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>100.02D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, プロテインG</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 低吸着マイクロチューブ, Xtreme</td><td>その他</td><td>Phenix Research Products</td><td>MAX-815S</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 2.0 ml</td><td>試薬</td><td>Eppendorf</td><td>955154037</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

後生動物の生物の細胞の無数の機能と構造の複雑さは、幹細胞の数が少ないから生じる。自己再生および多能ほぼすべての細胞の1型に分化する幹細胞を可能にする：幹細胞は、2つの基本的な性質によって特徴付けられる。分化した細胞への進行の幹細胞は、活動の確立と細胞型特異的遺伝子発現パターンを維持するため、多能な構造と形態変化と転写因子の階層的活性とシグナル伝達分子、の損失によって特徴付けられる。分子レベルで、細胞の分化は、幹細胞と細胞の分化過程2,3の機能的特徴に貴重な洞察を提供することができるダイナミックなクロマチンの構造や組成の変化とそれらの動的変化の検出を行います。クロマチンは、タンパク質、主にヒストン4セルパッケージ染色体DNAを形成する高度に圧縮されたDNA -タンパク質複合体です。 Stemcellnessと細胞分化は、このようなエピジェネティックな因子、ヒストン変異体、および転写因子2,3,5のような調節タンパク質の特定の配列の存在と相関している。 クロマチン免疫沈降（ChIP）は、RNAの存在、タンパク質、およびクロマチン6,7におけるタンパク質修飾を監視するための貴重な方法を提供する。異なる種類の細胞からクロマチンの比較では、細胞分化時に発生するタンパク質-クロマチン団体のダイナミックな変化を解明することができます。 クロマチン免疫沈降法はin vivoで架橋クロマチンでの精製を含む。分離されたクロマチンは、酵素消化または機械的な力によってより小さな断片に還元される。クロマチンの断片は、タンパク質またはタンパク質とDNAの変化を標的とする特異的抗体を用いて沈殿させる。沈殿したDNAまたはRNAを精製し、PCRやDNAマイクロアレイを用いたアッセイのためのテンプレートとして使用されます。成功したChIPの前提条件は、所望の抗原と標的分子を発現していないコントロール細胞からクロマチンの可用性への高品質な抗体です。 CHIPは蛋白質、蛋白質とRNAの変更、および特定の標的DNAとRNAの存在を相互に関連付け、そして、outreadツールの選択に応じて特定の標的遺伝子で、またはゲノム全体の文脈における標的分子の結合を検出することができます。分化細胞のクロマチン中のタンパク質の分布の比較では、細胞系列に沿って細胞の進行に合わせクロマチン構成の動的変化を解明することができます。

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。

後生動物における無数の細胞の機能的および構造的な複雑さは、少数の幹細胞から生じます。幹細胞とは...

こんにちは、カリフォルニア大学リバーサイド校生化学科のFrank Zawa博士の研究室に所属しているStefan Buraniです。本日は、クロマチン免疫沈降のプロトコルをご紹介します。それでは始めましょう。この手順は、ヒト胚性幹細胞のホルムアルデヒドによる架橋から始まります。架橋を行う前に、ヒト胚性幹細胞を液体窒素から取り出し、37 °Cで5分間解凍した後、培地で洗浄します。次に、細胞をゼラチンコートした6ウェルプレートに播種し、2〜3日間増殖させます。各免疫沈降反応につき、5,000万から1億個の細胞から開始する必要があります。まず細胞を単一細胞化し、浮遊状態で回収します。各細胞懸濁液に、濃度1%の新鮮なアルデヒドを添加し、室温で10分間インキュベートします。次に、ホルムアルデヒドをクエンチさせるため、1.25 M のグリシンを全量の10分の1量加え、10分間インキュベートします。細胞を10 mLのPBSで2回洗浄し、50 mLコニカルチューブに回収します。遠心分離機を用い、4°Cで1000 RPMで5分間遠心分離し、細胞をペレットとして回収します。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを1.5 millilitersのlyce bufferで再懸濁します。最後に、細胞を1.5 milliliterのマイクロフュージチューブに移します。細胞の移動後、液体窒素で3回急速凍結させ、組織ホモジナイザーを用いて破砕します。細胞の架橋後、免疫共沈降に使用するか、-80 °Cで凍結保存して長期保存することが可能です。細胞を架橋させた後、免疫共沈降を行うために磁性ビーズを準備する必要があります。低吸着マイクロチューブ1.5 mLにDIビーズ50 µLを分注し、免疫共沈降1回につき1本のビーズ用チューブを用意してください。次に、ブロッキング液を1 mL加えます。続いて、dyal MPCを用いてdyalビーズを回収します。チューブをマグネットラックに設置してください。ビーズをチューブの側面に集めます。これには約15秒かかります。ラックを2回反転させると、ビーズを集めやすくなります。ビーズを回収した後、ピペッターで上清を除去します。上清を除去した後、ブロッキング溶液を1 mL加え、ラックからマグネットストリップを取り外してラックを反転させ、ビーズを穏やかに再懸濁します。チューブをセットしたまま、この操作を10～20回、またはビーズが均一になるまで繰り返します。以前と同様の手順で、ビーズを再懸濁して回収します。回収後、ピペッターで上清を除去します。1.5 millilitersのブロッキング溶液を用いて、この洗浄操作を繰り返します。2回目の洗浄後、ビーズを750 µLのブロッキング溶液で再懸濁し、10 µgの抗体を添加します。本研究では、MLLタンパク質に対する抗体を使用し、混合物を4 °Cで最低6時間、または回転ミキサーを用いて一晩インキュベートします。このインキュベーションの間に、クロスリンクしたクロマチンの超音波処理を行うことができます。これについては、一晩のインキュベーション後に詳しく説明します。抗体溶液を除去し、ビーズを3回洗浄します。前回と同様に1 mLのlyase bufferを使用し、マグネットラックを用いてビーズを回収してください。洗浄後、飽和クロマチンを添加する準備が整います。ソニケーションを開始する前に、まず-80°Cで保存された凍結細胞ペレットを取り出し、解凍させます。ソニケーション用に15 mLコニカルチューブを準備します。これは、チューブの5 mLの印で2つに切り、上半分を廃棄することで行います。チューブはパラフィルムまたはチューブキャップで密閉できます。セットアップ時に、チューブラックを使用して、オートライザープローブがチューブ底面から約0.5〜1 cm上の位置にくるようにチューブを配置します。溶液の泡立ちを防ぐため、プローブが中心に位置し、チューブの側壁に接触していないことを確認してください。次に、サスペンションを20秒間×6回のサイクルで超音波処理します。泡立ちを抑えるため、超音波処理の各サイクルの間に、各サンプルを氷水浴に浸して保持してください。最初に出力をゼロに設定し、最初のバースト中に手動で最終出力まで上げます。その後、材料を1.5 mLチューブに移し、4 °Cで13,000 RPMにて10分間遠心分離します。これにより、デブリを沈殿させ、上清を回収します。SINAを新しい1.5 milliliterチューブに移します。各サンプルの細胞溶解液から50 microlitersを、入力用DNAとして保存しておきます。これは後で、共有クロマチンのサイズを確認するために使用します。これは-20 °Cで保存可能です。超音波処理したライセートのバッチごとに、少なくとも1つの入力DNA分注を保持しておく必要があります。これで、クロマチンの免疫沈降を行う準備が整いました。まず、前のステップで回収した、5,000万〜1億個の細胞に相当するクロマチンを、あらかじめ調製した50 µLの抗体磁気ビーズミックスに加え、最終容量を1 mLとします。必要に応じて、ライシスバッファーでこの容量を調整し、転倒混和して再懸濁させます。この混合物を、4 °Cの回転機で一晩インキュベートします。インキュベーション後、磁石を用いてビーズを回収し、チューブをラックに設置して、ビーズがチューブの側面に集まるようにします。この操作には約20秒かかります。その後、ラックを2回傾けて、すべてのビーズを確実に回収してください。次に、ピペッターを用いて上清を除去します。その際、サンプルごとにチップを交換してください。続いて、ビーズを洗浄します。各チューブに1 mLのlyase bufferを加え、ビーズを穏やかに再懸濁させます。これは、ラックからマグネットストリップを取り外し、チューブを入れたままの状態でラックを10〜20回、またはビーズが均一に再懸濁されるまで反転させることで行えます。その後、マグネットストリップを元に戻してビーズを回収します。上清をピペッターで取り除きます。この洗浄をさらに3〜5回繰り返します。洗浄ごとにチップを交換することを忘れないでください。次に、上述した方法で、1 mLのIP one bufferを用いてビーズを4〜6回洗浄します。同様に、ビーズを1 mLのIP twoバッファーで4〜6回洗浄します。最後に、他の洗浄操作と同様に、ビーズを1 mLのTEバッファー（pH 8.0）で4〜6回洗浄します。最終洗浄後、TEバッファーを除去します。次に、3000 RPMで3分間、4°Cで遠心分離し、残留しているTE bufferを除去します。これでビーズはクロマチンの溶出準備が整いました。まず、210 µLのelution bufferを加え、チューブを800 RPMの65°Cサーマルミキサーで15分間、あるいは溶出物の回収率を向上させるために最大30分間インキュベートして、ビーズから物質を溶出させます。ビーズを13,000 RPMで1分間遠心分離します。遠心分離後の温度を確認し、上清を200 µL取り出して新しいチューブに移し、そこに200 µLのTE 0.0を加えます。これで、沈殿したDNAの架橋を解除する逆架橋処理の準備が整いました。上清を65 °Cの恒温水槽で、最低6時間から最大15時間インキュベートします。結露を最小限に抑えるため、このインキュベーションは水槽を用いて行ってください。次に、50 µLの入力DNAを添加します。ソニケーション後、溶出液と同様に65°Cでインキュベートし、この入力DNAの逆交差結合を解消させました。これでDNAを精製する準備が整いました。次に、フェノール・クロロフォーム抽出を行い、続いてエタノール沈殿法を用いてDNAの精製と沈殿させます。沈殿したDNAペレットを水で再懸濁し、その後-20°Cで保存できます。今後の使用に備え、精製した入力DNAをアガロースゲル電気泳動にかけ、断片化したクロマチンのサイズを確認できます。理想的には、クロマチンは250から750 baseの間である必要があります。以上で、ヒト胚性幹細胞を用いたクロマチン免疫共沈降法の手順を説明しました。この実験を行う際は、高親和性の抗体を使用し、適切なサイズ範囲のクロマチンを回収し、高ストリンジェンシーの洗浄ステップを行うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。...

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム...

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA...

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。...

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

学ぶクロマチン免疫沈降法によるヒト胚性幹細胞の分化メカニズム解析。ホルムアルデヒド架橋、ソニケーション、抗体を用いた免疫沈降でタンパク質-DNA相互作用を解明し、幹細胞生物学の理解を深める。

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

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