ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

こんにちは、カリフォルニア大学リバーサイド校生化学科のFrank Zawa博士の研究室に所属しているStefan Buraniです。本日は、クロマチン免疫沈降のプロトコルをご紹介します。それでは始めましょう。

この手順は、ヒト胚性幹細胞のホルムアルデヒドによる架橋から始まります。架橋を行う前に、ヒト胚性幹細胞を液体窒素から取り出し、37 °Cで5分間解凍した後、培地で洗浄します。次に、細胞をゼラチンコートした6ウェルプレートに播種し、2〜3日間増殖させます。

各免疫沈降反応につき、5,000万から1億個の細胞から開始する必要があります。まず細胞を単一細胞化し、浮遊状態で回収します。各細胞懸濁液に、濃度1%の新鮮なアルデヒドを添加し、室温で10分間インキュベートします。

次に、ホルムアルデヒドをクエンチさせるため、1.25 M のグリシンを全量の10分の1量加え、10分間インキュベートします。細胞を10 mLのPBSで2回洗浄し、50 mLコニカルチューブに回収します。遠心分離機を用い、4°Cで1000 RPMで5分間遠心分離し、細胞をペレットとして回収します。

遠心分離後、上清を捨て、ペレットを1.5 millilitersのlyce bufferで再懸濁します。最後に、細胞を1.5 milliliterのマイクロフュージチューブに移します。細胞の移動後、液体窒素で3回急速凍結させ、組織ホモジナイザーを用いて破砕します。

細胞の架橋後、免疫共沈降に使用するか、-80 °Cで凍結保存して長期保存することが可能です。細胞を架橋させた後、免疫共沈降を行うために磁性ビーズを準備する必要があります。低吸着マイクロチューブ1.5 mLにDIビーズ50 µLを分注し、免疫共沈降1回につき1本のビーズ用チューブを用意してください。

次に、ブロッキング液を1 mL加えます。続いて、dyal MPCを用いてdyalビーズを回収します。チューブをマグネットラックに設置してください。

ビーズをチューブの側面に集めます。これには約15秒かかります。ラックを2回反転させると、ビーズを集めやすくなります。

ビーズを回収した後、ピペッターで上清を除去します。上清を除去した後、ブロッキング溶液を1 mL加え、ラックからマグネットストリップを取り外してラックを反転させ、ビーズを穏やかに再懸濁します。チューブをセットしたまま、この操作を10～20回、またはビーズが均一になるまで繰り返します。

以前と同様の手順で、ビーズを再懸濁して回収します。回収後、ピペッターで上清を除去します。1.5 millilitersのブロッキング溶液を用いて、この洗浄操作を繰り返します。

2回目の洗浄後、ビーズを750 µLのブロッキング溶液で再懸濁し、10 µgの抗体を添加します。本研究では、MLLタンパク質に対する抗体を使用し、混合物を4 °Cで最低6時間、または回転ミキサーを用いて一晩インキュベートします。このインキュベーションの間に、クロスリンクしたクロマチンの超音波処理を行うことができます。これについては、一晩のインキュベーション後に詳しく説明します。

抗体溶液を除去し、ビーズを3回洗浄します。前回と同様に1 mLのlyase bufferを使用し、マグネットラックを用いてビーズを回収してください。洗浄後、飽和クロマチンを添加する準備が整います。

ソニケーションを開始する前に、まず-80°Cで保存された凍結細胞ペレットを取り出し、解凍させます。ソニケーション用に15 mLコニカルチューブを準備します。これは、チューブの5 mLの印で2つに切り、上半分を廃棄することで行います。

チューブはパラフィルムまたはチューブキャップで密閉できます。セットアップ時に、チューブラックを使用して、オートライザープローブがチューブ底面から約0.5〜1 cm上の位置にくるようにチューブを配置します。

溶液の泡立ちを防ぐため、プローブが中心に位置し、チューブの側壁に接触していないことを確認してください。次に、サスペンションを20秒間×6回のサイクルで超音波処理します。泡立ちを抑えるため、超音波処理の各サイクルの間に、各サンプルを氷水浴に浸して保持してください。

最初に出力をゼロに設定し、最初のバースト中に手動で最終出力まで上げます。その後、材料を1.5 mLチューブに移し、4 °Cで13,000 RPMにて10分間遠心分離します。これにより、デブリを沈殿させ、上清を回収します。

SINAを新しい1.5 milliliterチューブに移します。各サンプルの細胞溶解液から50 microlitersを、入力用DNAとして保存しておきます。これは後で、共有クロマチンのサイズを確認するために使用します。

これは-20 °Cで保存可能です。超音波処理したライセートのバッチごとに、少なくとも1つの入力DNA分注を保持しておく必要があります。これで、クロマチンの免疫沈降を行う準備が整いました。

まず、前のステップで回収した、5,000万〜1億個の細胞に相当するクロマチンを、あらかじめ調製した50 µLの抗体磁気ビーズミックスに加え、最終容量を1 mLとします。必要に応じて、ライシスバッファーでこの容量を調整し、転倒混和して再懸濁させます。この混合物を、4 °Cの回転機で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、磁石を用いてビーズを回収し、チューブをラックに設置して、ビーズがチューブの側面に集まるようにします。この操作には約20秒かかります。その後、ラックを2回傾けて、すべてのビーズを確実に回収してください。

次に、ピペッターを用いて上清を除去します。その際、サンプルごとにチップを交換してください。続いて、ビーズを洗浄します。各チューブに1 mLのlyase bufferを加え、ビーズを穏やかに再懸濁させます。

これは、ラックからマグネットストリップを取り外し、チューブを入れたままの状態でラックを10〜20回、またはビーズが均一に再懸濁されるまで反転させることで行えます。その後、マグネットストリップを元に戻してビーズを回収します。上清をピペッターで取り除きます。

この洗浄をさらに3〜5回繰り返します。洗浄ごとにチップを交換することを忘れないでください。次に、上述した方法で、1 mLのIP one bufferを用いてビーズを4〜6回洗浄します。

同様に、ビーズを1 mLのIP twoバッファーで4〜6回洗浄します。最後に、他の洗浄操作と同様に、ビーズを1 mLのTEバッファー（pH 8.0）で4〜6回洗浄します。最終洗浄後、TEバッファーを除去します。

次に、3000 RPMで3分間、4°Cで遠心分離し、残留しているTE bufferを除去します。これでビーズはクロマチンの溶出準備が整いました。まず、210 µLのelution bufferを加え、チューブを800 RPMの65°Cサーマルミキサーで15分間、あるいは溶出物の回収率を向上させるために最大30分間インキュベートして、ビーズから物質を溶出させます。

ビーズを13,000 RPMで1分間遠心分離します。遠心分離後の温度を確認し、上清を200 µL取り出して新しいチューブに移し、そこに200 µLのTE 0.0を加えます。これで、沈殿したDNAの架橋を解除する逆架橋処理の準備が整いました。

上清を65 °Cの恒温水槽で、最低6時間から最大15時間インキュベートします。結露を最小限に抑えるため、このインキュベーションは水槽を用いて行ってください。次に、50 µLの入力DNAを添加します。

ソニケーション後、溶出液と同様に65°Cでインキュベートし、この入力DNAの逆交差結合を解消させました。これでDNAを精製する準備が整いました。次に、フェノール・クロロフォーム抽出を行い、続いてエタノール沈殿法を用いてDNAの精製と沈殿させます。

沈殿したDNAペレットを水で再懸濁し、その後-20°Cで保存できます。今後の使用に備え、精製した入力DNAをアガロースゲル電気泳動にかけ、断片化したクロマチンのサイズを確認できます。理想的には、クロマチンは250から750 baseの間である必要があります。

以上で、ヒト胚性幹細胞を用いたクロマチン免疫共沈降法の手順を説明しました。この実験を行う際は、高親和性の抗体を使用し、適切なサイズ範囲のクロマチンを回収し、高ストリンジェンシーの洗浄ステップを行うことが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。