Name: 上丘の表面上にフッ素金の適用により網膜神経節細胞の逆行性標識法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 学ぶ 上丘へのフッ素金適用法によるラット網膜神経節細胞の逆行性標識技術。神経保護薬効評価や細胞死解析に応用可能な神経解剖学的手法です。

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著者はアメリカの健康アシスタント財団のナショナル緑内障のプログラムからの支援を感謝したいと思います。

<ol><li>ケタミン（80mg/kg）とキシラジン（8mg/kg）（2:1体積比）の腹腔内注射によってラットをAnaesthetize。手術中に角膜の乾燥を防ぐために無菌の目の潤滑剤の軟膏を適用します。 </li><li>頭の毛皮を（目から耳のレベルに）ひげをそると、ヘッドクランプして、ヘッドステージにヘッドを固定し、切歯のバーでその歯を設定します。 </li><li>消毒操作の70％アルコールで10％のポビドンヨード溶液によるエリア。 </li><li>皮膚と頭蓋骨と縫合（矢状、冠状および横縫合）（図1）を公開する筋肉をカット。切開のエリアへのスプラッシュ（2 mg / kg体重を超えてはならない）として鎮痛剤、bupivicaineを適用します。 </li><li>矢状縫合の各側の頭蓋骨の穴（φ2 × 2 mmの矢状及び横縫合の両方から0.5mm）ドリル。髄膜の破裂や縫合糸の下に横たわって洞を避けてください。 <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="生きているラットの頭蓋骨に特徴。" width="469" height="317" /> 図1。生きているラットの頭蓋骨に特徴。 </li><li>春のはさみで髄膜を切り開く、涙を避ける。 </li><li>真空ポンプによって慎重に上丘の背側表面上に位置し、3つのチェックポイントを観察することができる脳のコンテンツを吸引除去する。 <ol><li>灰色から白に灰色の脳組織の色が変わります</li><li>無色の脳脊髄液が出てくる時に吸引を停止します</li><li>慎重に硬膜で覆わ黄色上丘を公開するために水平に最低吸引レベルを拡大</li></ol></li><li> SCの4辺を直接顕微鏡で観察できるようになるまで、SC上の脳の内容を吸引除去する。削除された大脳皮質の部分は、望ましくない副作用（例えば、運動機能障害）を避けるために最小限に抑える必要があります。洞に触れないように注意してください。 </li><li>できるだけSCの表面が乾いたように微細な滅菌綿のストライプで穴に水分を吸収する。その後、ゼラチンスポンジの薄層を配置し、事前に浸したSCの表面上に6％フルオロゴールド（FGは網膜神経節細胞の軸索末端で取り込まれ、両側網膜におけるSOMAのために逆行性に輸送される）と。 </li><li> gelfoamで穴を埋め、縫合クリップで皮膚の傷を閉じます。 </li><li>動物は暖かい保つために白熱灯の下で回復させた。鎮痛、ブプレノルフィン（100mcg/kg）は、SCの標識後の5日間飲料水で経口適用されます。 </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li>なぜ網膜神経節細胞数のためにこの手術方法を使うのか？ ラットでの網膜神経節細胞（RGC）の約98％は対側上丘（SC）に投影することが知られています。我々は緑内障で、この最も脆弱な網膜神経細胞に集中できるように、SCの表面にフッ素金を適用するには、RGCsのほぼすべてのラベルを付けることができます。 2日間transected視神経の切り株でFGを入れておけば、RGCの逆行性標識法と比較し、RGC生存の干渉が最小限に抑えられます。網膜神経節細胞層で血管の汚れはアマクリン細胞、RGCおよび内皮細胞、このメソッドはRGCに対してより特異的であることをクレシルバイオレット染色と比較してください。 </li><li>過度の出血を回避する方法？ 最初に、ラットでは筋緊張と角膜の反射をチェックして適切に麻酔していることを確認してください。不十分な麻酔では、広範な出血の原因となります。第二に、このような縫合に近すぎるドリルや副鼻腔の壁に髄膜の断裂などの副鼻腔を損傷することがある操作を避ける。第三に、硬膜は、特に鼻の領域でSCをそのままに、表面的に横たわっているように十分注意してください。 ...

上丘の表面上にフッ素金の適用により網膜神経節細胞の逆行性標識法

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

網膜神経節細胞（RGC）計数は、特に緑内障の網膜変性を評価するために不可欠です。信頼性のRGCのラベリングは、任意の治療の効果を評価するための基本です。ラットでは、RGCsの約98％は対側上丘（SC）（フォレスターとピーターズ、1967）に投影することが知られている。我々は緑内障で、この最も脆弱な網膜神経細胞に集中できるように、SCの表面にフッ素金（FG）を適用することは、ほとんどすべてのRGCsにラベルを付けることができます。 FGは、網膜神経節細胞の軸索終末に取り込まれ、両側網膜におけるSOMAのために逆行性に輸送される。 2日間transected視神経の切り株でFGを入れておけば、RGCの逆行性標識法と比較し、RGC生存の干渉が最小限に抑えられます。汚れのRGCs、アマクリン細胞と網膜神経節細胞層での血管の内皮細胞は、この標識法はRGCに対してより特異的であることをクレシルバイオレット染色と比較してください。このビデオでは、SCの表面にFG適用することにより、RGCの逆行性標識法の方法を説明します。 SCを公開する皮質を吸引し、SCの全体の背側表面上にゼラチンスポンジを適用して表示され、外科的手技は、頭蓋骨をドリル含まれています。 SCの巨大な頭蓋内出血と誤嚥を避けるための有用なヒントが与えられている。

このビデオでは、上丘（SC）の表面にフッ素金（FG）を適用することで、RGCの逆行性標識法の方法を説明します。テクニックは、頭蓋骨をドリル皮質を吸引し、SCの全体の背側表面上にゼラチンスポンジを適用する必要があります。

網膜神経節細胞（RGC）の計数は、特に緑内障における網膜変性を評価するために不可欠です。信頼性の高いRGCの標識は、...にとって極めて重要です。

こんにちは、香港大学GOSOラボのTuです。本日は、ラット網膜神経節細胞のレトログレード・グリッド・ラベリング法についてご紹介します。網膜神経節細胞をレトログレードに標識するため、上丘の表面に蛍光色素を塗布します。これにより、後で平坦に作製した網膜上の網膜神経節細胞をカウントし、細胞死や投与した薬剤の効果を評価することが可能になります。これは、網膜から上丘に至る経路を示した写真です。蛍光色素は、視索を介して上丘からレトログレードに輸送されます。視神経を通じて視神経鞘を眼球の網膜まで通します。手術には手術用顕微鏡を使用します。大脳皮質を吸引するためにウェルカムポンプを使用し、レッドハットの位置を固定するためにCLEヘッドステージを使用します。ラットの頭蓋骨を穿孔して開口部を作成するためのドリルおよび、蛍光染料FGを皮質表面に塗布するための吸収性スポンジを使用しました。精密ピンセット、スプリングシザー、吸引針、ドリルチップ、および縫合クリップを含む器具は、術前にオートクレーブで滅菌しました。皮膚切開用の手術用メス、測定用の定規、および脱脂綿も同様に滅菌状態で準備しました。ケタミンとシネゲルの腹腔内投与により、ラットを麻酔しました。眼の高さから耳の高さまで側頭部を剃毛した後、手術部位をポビドンヨード、次に70%アルコールで消毒しました。その後、ヘッドステージ上にラットの頭部を固定しました。目の高さから耳の高さまで、頭部の中央線に沿って皮膚を切開します。これにより、冠状縫合、矢状縫合、人字縫合が十分に露出します。ここがブレグマであり、ここがラムダです。人字縫合の前端から0.5〜1 mmの位置にスクリューの印を付け、その後、両側で鏡面状にラベルを貼り、印が縫合線から少なくとも0.5 mm離れていることを再度確認します。次に、マーカーに沿って穿孔を開始します。ドリルの速度と方向を制御し、縫合線下の髄膜および静脈洞ライニングを十分に切開します。直径が約2 mmになった時点で穿孔を停止します。その後、反対側のミラーで再度確認し、穴のサイズと位置が適切であるかを確認します。スプリングシザースで髄膜を切開し、微細ピンセットを用いて孔内の骨片を除去します。これで、真空ポンプを用いた吸引を開始できます。BRの第1層は緑色の物質であり、これを再び髄膜とともに切除します。次に、tcellの色が白く変化するのがわかります。これが脊髄の白質です。吸引はゆっくりと丁寧に行ってください。これで、再び灰白質を確認することができます。色が白から変化しています。底部が灰色になっているのがわかります。なるほど。このように、透明なCSFが流出しているのがわかります。これは、上側脳室の背側に到達したことを意味しています。このレベルで再び孔を拡大します。すると、底部で上槽を覆う黄色い硬膜が確認できます。上槽

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生物学

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。軸索は完全に軸索切断後14日以内に死亡する（軸索切断）transectedされる網膜神経節細胞（RGCs）の90％。このモデルは、実験操作に簡単に従順し、再現性の高いです。...

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。このモデルは、世界的に網膜をターゲットにするか、直接網膜神経節細胞の損傷した神経細胞集団を対象に実験操作の数を実行するための理想的です。...

哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。...

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

蛍光色素ラベル解剖投影に基づくニューロンの亜集団の逆行性輸送。標識された軸索は、視覚的に対象とすることができます...

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

出典:Zhang, J., et al.網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的免疫金分析。J. Vis.

網膜シナプスにおける神経伝達物質受容体の高解像度イメージング

出典:Inal, M. A. et.al., 親油性蛍光色素を使用したショウジョウバエ胚運動ニューロンの逆行性トレース。J. Vis. Exp.

蛍光親油性色素を用いたショウジョウバエ運動ニューロンの逆行性標識

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere,  et. al.網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

私たちは、成体のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞(RGC)を逆行させる効率的な方法を紹介します。...

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

ポストエンベッドイムノゴールド法は、特定の分子の細胞内局在を高解像度で分析するための最も効果的な方法の一つです。ここでは、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体を定量的に解析するためのプロトコールについて述べます。...

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。...

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

学ぶ 上丘へのフッ素金適用法によるラット網膜神経節細胞の逆行性標識技術。神経保護薬効評価や細胞死解析に応用可能な神経解剖学的手法です。

上丘の表面上にフッ素金の適用により網膜神経節細胞の逆行性標識法

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