げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

こんにちは。タフツ大学医学部薬理学・実験治療学部のEmmanuel Pothos研究室のLauren Frankです。そして、Emmanuel Pothosです。本日は、新生子ラットまたはマウスから中脳ドーパミン作動性神経細胞の一次培養を調製する手順をご紹介します。

この手順には、器具と試薬の準備、出生後0日から2日（P0〜P2）のげっ歯類脳の中脳の解剖、脳セグメントの回転、および解離したニューロンの播種というステップが含まれます。それでは始めていきましょう。

この手順では、ドパミン作動性ニューロン培養を開始する2～3週間前にあらかじめ実施すべき準備ステップがいくつかあります。グリア細胞を播種し、増殖してディッシュの底面を覆うまでの時間を確保する必要があります。一次ドパミン作動性ニューロンは、一次ニューロン細胞の培養の1～7日前に、グリア細胞の単層上に培養されます。AC培養の前日に、グリア細胞から培地を除去し、2 mLの新鮮なニューロン培地と交換します。12枚の解剖プレートを含む、解剖器具以外のすべてのアイテムは、UVライトを用いて滅菌させる必要があります。

マイクロマグネチックスターラーバーを入れた2本の解離用バイアル。上部に2つの小さな穴を開けた2本のバイアルキャップ。広げられたスライドリング。

また、スライドリングボックスは開けたままにしておいてください。これらの器具はすべて、培養当日の開始前に70%ethanolで消毒します。まず、一次ニューロン溶液を解離させるために使用するpepane溶液の全構成成分をフリーザーから取り出し、解凍させます。

ホットプレートをセットし、ビーカーに入れた水を34°Cに加熱して消化に備えると同時に、ペパン溶液の酸素供給用にカルボゲン飽和水を用意します。消化の間、解剖前に脳を洗浄するための、sterile PBSを4〜6 mL入れた15本の滅菌チューブを準備し、氷上に置きます。また、20〜30 mLの新鮮な神経細胞用培地を分注し、インキュベーターに入れます。

次に、滅菌済みのフリップフィルターユニットを用いてペパイン溶液をろ過し、それを解離用バイアルに移して解離用バイアルを準備します。25 mLのストレップキャップでバイアルを密閉し、0.2 µmフィルターに接続した滅菌シリンジをキャップに穴を開けて挿入します。フィルターにカーボジェンを接続し、パラフィルムで固定します。バイアルをスチロール製ディスクに設置します。

解離用バイアルを設置したら、マグネチックスターラーが回転していることを確認します。ガスがバイアル内に導入され、温度が 34 °C で安定している状態にします。解剖顕微鏡をフード内に配置し、解剖器具をアルミホイルの上に並べます。

次に、大きなアルミホイルを1枚、小さな正方形のアルミホイルを12枚用意します。アルミホイルを用いた脱頭（decapitation）に使用するハサミを準備しておきます。フードの外に、氷水を入れた発泡スチロール製ボックスを配置します。

次に、ケタミン 0.075 milliliter とキシラジン 0.075 milliliter の混合液である麻酔薬を調製します。その後、23 millimeter のガラスウェルを備えた 135 millimeter プレート用に、P0からP2の幼マウスを少なくとも12匹用意します。マウスについては、同じリター内でジェノタイプが一致していることを確認してください。

遺伝子型が不明な場合は、個体ごとの細胞を別々のディッシュに播種し、後の遺伝子型判定の結果と細胞を照合できるよう正確な記録を保持する必要があります。解剖を開始するために、まずケタミン・キシラジンを腹腔内投与して動物を麻酔させます。テールフリックテストに反応しなくなった後、低体温状態になるまで30秒間氷水に浸します。

次に、小さな正方形のアルミホイル1枚を準備し、断頭用ハサミと動物の頭部を70% ethanolで洗浄して、解剖中の脳組織への汚染を防ぎます。ハサミで断頭し、頭部をアルミホイルの上に落としてから、フード内に移動させます。まず小さなハサミで皮膚を切って頭蓋骨を露出させ、慎重に脳を取り出します。頭蓋骨の周囲を360度切り開きます。

次に、ピンセットで頭蓋冠を剥がします。小型スパチュラを用いて脳を頭蓋骨から取り出し、氷冷したPBSが入った15 milliliterチューブに移します。次の脳を取り出す前に、チューブを再び氷上に置いて冷却してください。

氷上の別々のチューブに3つの脳が入るまで、解剖を繰り返します。1つの脳とPBSを1枚目の解剖皿に注ぎます。顕微鏡下で、ブレードの切れ味を維持するため、クッションとしてシルガード接着剤の台の上に脳を配置します。

トランスファーピペットを使用して、セグメントを新しいPBSチューブに移し、ペパイン溶液に移す前にセグメントを洗浄します。最初のセグメントを入れた時にタイマーを開始し、すべての脳がペパイン溶液で消化されるまで解剖を続けます。

最初の脳セグメントは約1時間消化が進んでいる状態になります。最後のセグメントを追加した後、さらに1時間消化を継続させてください。ペパンバスの温度が34 °Cで安定していることを確認してください。

固定ステップを開始するために、転送ピペットを使用して脳切片を滅菌済みの15 milliliterチューブに移します。過剰なpepane溶液が混入しないように注意してください。もし混入した場合は、過剰なpepaneを除去してください。

次に、インキュベーターから取り出した温めたニューロン培地を2 mL加え、セグメントを洗浄します。セグメントが沈殿するまで待ち、セグメントを乱さないように注意して、可能な限り溶液を廃棄します。この洗浄操作を計3回行います。

コンタミネーションを防ぐため、洗浄ごとに新しいピペットに交換してください。2 mLのニューロン用培地で反復操作を開始します。気泡が入らないように注意しながら、25回トリチュレーションを行います。

次に、未結合のセグメントを3分間静置します。底部のセグメントを乱さないように、トランスファーピペットを用いて可能な限り上清を回収します。回収した上清は、新しい滅菌済みの15 milliliterチューブに保存してください。

1000 µLのピペットチップ、続いて200 µLのチップを使用して前述のステップを繰り返し、組織片が視覚的に完全に解離していることを確認します。すべての操作で得られた上清は、同じ15 mLチューブに回収します。これで細胞の播種準備が整いました。最後に、転送ピペットで10回繰り返し混ぜ合わせ、細胞計数用の均一な細胞懸濁液を作成します。

滅菌済みの黄色いピペットチップでピンセットの先端を覆います。スライドリングを、ガラス面の中央にできるだけ正確に配置するように慎重に落とします。各ディッシュ内のこれらのリングは、培養ディッシュ内でニューロンを播種する領域を隔離するために使用されます。

ピペットチップを使用して、各ディッシュの中心ウェルにリングをスライドさせて配置します。次に、適切な量の細胞をディッシュに緩やかに添加します。細胞は、あらかじめディッシュ内に配置したリングの中心に加えてください。

皿ごとにチップを交換することを忘れないでください。次に、ニューロンの増殖を促進するため、各皿のリングの外側にできるだけ近づけて、希釈したGDNF溶液を100 µL添加します。続いて、グリア細胞の過剰増殖を防ぐため、有糸分裂阻害剤であるフルオロジオキシン（FDU）をリングの外側に添加します。

ピペットチップを戻し、細胞を一晩静置します。翌日、滅菌済みのピペットチップでピンセットの先端を覆い、リングを取り除いてから、ディッシュをインキュベーターに戻し、実験まで可能な限り刺激を与えないようにします。毎日、ディッシュにコンタミネーションがないか確認し、認められた場合は直ちに問題のあるディッシュを除去してください。培養細胞は3週間以内に、電気生理学、分子生物学実験、および免疫細胞化学に使用可能な状態になります。

細胞を播種しましたので、培養細胞の代表的な例をいくつか見ていきましょう。ここでは、14日前に播種した一次培養細胞を確認しています。細胞体から突起が伸びているのが明確に見て取れるため、これは良好な培養例と言えます。

さらに、感染を示すようなカビや真菌の増殖がディッシュ内にないことを確認してください。以上で、新生仔 rodents から原初分散中脳ドパミン細胞培養物を調製する方法を説明しました。この手順を行う際は、無菌環境を維持し、P0からP2の新生仔のみを使用し、グリア条件化培地を用いて健全なグリア基材上に播種し、一定の播種密度を維持することが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。