マトリゲル上のMEFから分割ヒトES細胞：MEFのからマトリゲル2〜
2008年6月9日
このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。 3パート2。
ヒト胚性幹細胞培養を維持するためには、培養培地を24時間ごとに交換する必要があります。これを行うには、摂氏4度で保存された胚性幹細胞培地ストックボトルから始めます。必要な量の溶液を取り出します(通常は6個あたり約20ミリリットルです)。
ウェルプレートでその量を50ミリリットルのファルコンチューブに入れ、内容物の入ったチューブをウォーターバスで摂氏37度に温めます。培地が温められたら、摂氏4度で保存したFGFを最終濃度10ナノグラム/ミルまで加えます。使用後すぐにBFGFストックを摂氏4度に戻すことを忘れないでください。
ヒトアモックス幹細胞培養培地中のBFGFが完全に混合されていることを確認してください。次に、各ウェルからすべてのメディアを取り出し、ウェルあたり約500マイクロリットルを残します。次に、3ミリリットルの新鮮な培地を6ウェルプレートの各ウェルに戻し、プレートをインキュベーターに戻します。
ヒト胚性幹細胞ONMを維持する方法を示したので、次はそれらをマトリゲルに移す方法を紹介します。ONMを成長させたヒト胚性幹細胞をマトリゲルに分割するには、まずCofluent 6ウェルプレートの幹細胞をmes上に置き、これを1対2または1対3でマトリゲルに分割します。6つのウェルプレート。
これにより、分割後4〜5日で井戸が再び合流するようになります。ヒト胚性幹細胞をマトリゲル上に分裂させる場合は、多能性を維持するためにメスコンディショニング培地をあらかじめ作製しておいていただきたい。これは、成長中の覚せい剤培養物から5ナノグラム/milのBFGFを7日間毎日補充した培地を採取することによって行われ、胚性幹細胞培地を使用して除去された覚せい剤馴染培地を置き換えます。
毎日。覚せい剤に馴染ませた培地は、採取して冷凍保存してから最大1ヶ月間使用する必要があります。ヒト胚性幹細胞が分裂する前日に、EORチューブ内のマトリゲルアリコートをマイナス20°Cから4°Cに移動させ、一晩で解凍します。
1アリコートには2ミリグラムのマトリゲルが含まれており、これはワンシックスに必要な量です。ウェルプレート。分割の日に、解凍したマトリゲルのバイアルを1つ取ります。
6本ごとに、各バイアルをウェルプレート化し、6ミリリットルの冷たいD-M-E-M-F 12培地と混合します。これを氷の上に置いておくことを忘れないでください。6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの溶液を加えます。
次に、プレートを渦巻いてマトリゲルを表面に分布させ、マトリゲルで覆われたプレートを室温で少なくとも1時間インキュベートしてから、ヒト胚性幹細胞を分裂させます。ヒト胚性幹細胞を分割する前に、MESで幹細胞を1つのXPBS pH 7.4で1回洗浄します。次に、分割するウェルの各ウェルに1ミリリットルの温かいコラゲナーゼを1ミリグラム/ミルで4個加え、プレートを摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。
インキュベーション後、BFGFを含まない胚性幹細胞培地を1ミリリットル加えますそれぞれに、1ミリリットルのピペットを使用して幹細胞をプレートから吹き飛ばします。幹細胞の塊と死んだmesを含むすべての培地を15ミリリットルのファルコンチューブに集めます。細胞の大きな塊を5分間沈殿させ、幹細胞の塊がチューブの底にペレットを形成し、mesがスナットに浮遊したまま
になるようにします。細胞が落ち着いたように見えたら、上清を捨て、胚性幹細胞ペレットを懸濁させて細胞を洗浄します。BFGFを含まない胚性幹細胞培地を使用して、室温でGの200倍で5分間遠心分離します。細胞が回転している間に、室温のD-M-E-M-F 12でプレートを1ウェルあたり1ミルで洗浄し、1ミルあたり10ナノグラムを補充した2.5ミリリットルのコンディショニング培地を追加することで、幹細胞プレーティング用のマトリゲルプレートを調製できます。
遠心分離後のウェルあたりのBFGF。Resusは、10ナノグラム/milを添加した適切な量の覚せい剤調整培地にペレットを懸濁します。BFGFは、塊が均一でサイズが小さくなるまで、細胞懸濁液を数回上下にピペットで動かします。
次に、懸濁液をマトリゲルプレート上のウェルあたり0.5ミリリットルで分注して、最終容量としてウェルあたり3ミルを達成します。マトリゲルの場合、セルが追加された後の数学での通常の分割よりも高いコロニー密度を使用します。プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターに入れます。
ヒト胚性幹細胞をマトリゲルメス状態に維持すること。10ナノグラム/ミルを添加した培地。BFGFは、最大4〜5日間、24時間ごとに交換されます。
ヒト胚性幹細胞は通常、マトリゲル上での最初の分裂後に残留量のMEFで汚染され、マトリゲルからマトリゲルへの2回目の分裂により、幹細胞培養物を汚染するフィーダー細胞の痕跡が完全に除去されます。
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概要
このビデオは、フィード細胞フリー条件下でのヒト胚性幹細胞（hESC）の維持、連続的な継代、ならびに免疫蛍光顕微鏡による多能性の確認を示しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 細胞培養技術
- 多能性評価
背景
- ヒト胚性幹細胞（hESC）は、発生生物学と再生医療にとって重要です。
- フィード細胞フリーの培養条件は、hESCの維持を簡素化します。
- 多能性はhESCの主要な特徴であり、研究での使用に不可欠です。
- 免疫蛍光顕微鏡法は、多能性を評価する一般的な方法です。
研究目的
- フィード細胞フリー条件下でのhESCの維持技術を示すこと。
- hESCの連続的な継代のプロセスを示すこと。
- 免疫蛍光顕微鏡法を用いてhESCの多能性を確認すること。
使用した方法
- 24時間ごとに培養液を交換する。
- 使用前に培養液を37度セルシウスに温める。
- 指定された濃度で培養液にFGFを添加する。
- 多能性の確認に免疫蛍光顕微鏡法を用いる。
主な結果
- フィード細胞フリー条件下でのhESCの成功した維持。
- 効果的な連続的な継代技術のデモンストレーション。
- 免疫蛍光顕微鏡法によるhESCの多能性の確認。
- 培養液の準備と取り扱いの標準化されたプロトコル。
結論
- フィード細胞フリー条件は、hESC培養に適しています。
- これらの条件下で連続的な継代を効果的に行うことができます。
- 免疫蛍光顕微鏡法は、多能性を評価する信頼性の高い方法です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Transitioning human embryonic stem cells (hESCs) from mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder layers to feeder-free Matrigel systems enables standardized, scalable, and reproducible cell culture workflows for early discovery and translational research. This feeder-free adaptation reduces biological variability and supports the development of robust, high-confidence disease-relevant models for biopharma R&D. The approach directly impacts target validation and assay development pipelines by providing a consistent pluripotent cell source.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency maintenance and differentiation potential in a controlled, feeder-free environment.
- Reduces confounding variables from feeder cell contamination, supporting mechanistic de-risking and target confidence.
- Facilitates reproducible generation of disease-relevant cell types for pathway clarification and functional validation.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free hESC platform for downstream assay development and compound screening.
- Supports quantitative, reproducible outputs by minimizing feeder cell-derived variability.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for high-throughput screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Improves translational continuity by generating feeder-free hESC cultures suitable for preclinical model development.
- Aligns with biomarker discovery efforts by ensuring consistent cell state and reducing background noise.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, feeder-free cell expansion and maintenance.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions feeder-free hESC culture as a foundational capability spanning early discovery, lead identification, and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by enabling controlled pluripotency maintenance and differentiation studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hESC populations for compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Facilitates quantitative assessment of cell state and response to experimental variables.
- Translational Research: Provides continuity for preclinical model development and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized feeder-free hESC workflow for diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of hESC culture systems.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hESC culture, passaging, and pluripotency maintenance.
- Demands access to tissue culture infrastructure and quality-controlled Matrigel and media components.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, cell handling, and passaging protocols.
- May require adaptation for different hESC lines or downstream differentiation protocols.
- Residual feeder cell contamination is minimized after two passages on Matrigel, supporting workflow purity.
