潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Caldwell研究室（別名：Worm Shack）では、C. elegansにおける神経疾患のメカニズムを研究しています。実りある実験の一日を終えた後は、リフレッシュするためのレクリエーション活動で自分たちを労います。こんにちは、私はアラバマ大学生物科学科のCaldwell研究室に所属する学部生のAdam Knightです。

本日、私とチームのメンバーが、C. elegansにおけるドーパミン作動性ニューロン変性アッセイの実施方法を実演します。ドーパミン神経変性を持つ虫株と、疾患関連の候補遺伝子およびドーパミン作動性ニューロンを過剰発現するトランスジェニック株を交配させます。こんにちは、Caldwell研究室の大学院生、Adam Harringtonです。

今日は、ドーパミン神経細胞解析のための形質転換ウォームの準備方法について説明します。大学院生のShu Amichiです。ここでは、C. elegansのCEPおよびADEと呼ばれるドーパミン作動性神経細胞のアッセイ方法について解説します。

一般的に、ドーパミン作動性ニューロンにGFPのみを発現している線虫では、細胞死は認められません。しかし、CLEが存在すると、細胞死および加齢に伴う神経変性が観察されます。このアッセイを用いて、ドーパミン作動性ニューロンに外来遺伝子を共発現させることで、その遺伝子がCLE誘導性の毒性を増強または抑制するかどうかを判定できます。それでは、始めていきましょう。

ドーパミン作動性ニューロンの解析を行う前に、まず適切なGaN系統を交配させ、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーターdat-1の制御下でalphas nucleとGFPの両方を発現するL4期の個体8匹を交配プレートに配置する必要があります。次に、目的の候補遺伝子のドーパミン作動性ニューロン特異的な発現と、選別マーカーであるDS red 2のボディウォール筋細胞への発現を示す、L4期のトランスジェニックca個体2匹を加えます。各トランスジェニックコンストラクトについて、3つの安定したトランスジェニック系統を作製することが重要です。

したがって、この遺伝的交雑は、作成した3つの独立した安定系統それぞれに対して個別に実施する必要があります。2日後、さらに2〜3日が経過した時点で雄を回収して廃棄します。その後、F1世代を検査してください。

複数の雄の子孫が得られており、交配は成功しました。次に、雄の親から継承したGFP蛍光マーカーと、hamadi親から継承したDS red two蛍光体壁筋肉マーカーの両方を示す個体を、Aphrodite L4から各交配につき4匹ずつ、個別に新しいプレートに移植します。移植する個体は、まだ交配（mating）していないことを確実にするため、L4段階である必要があります。

オス個体がプレート上に存在している状態で、F2世代を産生させるために3〜4日間、個体を自然交配させます。次に、F2世代を回収します。その手順として、両方のセントマーカーを示す個体を5〜10匹選び、それぞれ個別のプレートに移します。

次に、ドパミン作動性ニューロンにおいて100%の個体がGFPを発現し、かつ一部の個体がボディウォール筋細胞にDsRed2蛍光マーカーを発現しているプレートを、F3世代からスクリーニングします。これらの個体は、α-synuclein遺伝子とGFP遺伝子の両方がホモ接合体であり、新しく作成した導入遺伝子を安定して伝達しています。スクリーニングが完了したら、ドパミン作動性ニューロンの解析を行う準備が整ったことになります。

ニューロン解析を開始するために、前ステップで特定した3匹の動物の新鮮なプレートを準備します。3つのトランスジェニック系統それぞれに対してプレートを用意してください。さらに、対照群としてα-synuclein GFP単独株をプレートに播種し、線虫を成体まで成長させます。

線虫が成虫になったら、各ラインから30〜40匹の形質転換個体を新しいプレートに移します。20 °Cで5時間、産卵させます。5時間後、個体を回収して廃棄します。

成体を用いて、胚を20 °CでL4期に達するまで3～4日間発生させます。次に、トランスジェニックのL4個体を約100匹選び、0.04 mg/mLの5-fluoro-2'-deoxyuridineを含むプレートに移します。

このヌクレオチド類縁体は、DNA合成を阻害することで次世代の発達を抑制します。FDURプレートは光に敏感であるため、プレートをカバーで覆い、完全に包んで遮光してください。線虫解析のためにアガロースパッドを作成します。

これらは新鮮な状態で使用し、乾燥させないようにします。テープを縦方向に貼った顕微鏡スライドガラスを2枚用意します。このテープは、パッドの厚さを均一にするためのスペーサーとして機能します。

それらの間に3枚目のスライドをベンチ上に置きます。これで、3枚が横に並んで配置されました。

溶融したアガーを中央に1滴滴下し、その上に別のスライドガラスを垂直に重ね、3枚のスライドガラスすべてにわたるように素早く配置します。分析するサンプル数に応じて、必要数分だけアガーパッドを同様に作成します。アガーパッドの準備ができたら、22 by 30 mmのカバーガラス上に、3 mMの11-mile sawおよび麻酔剤を6 µL滴下します。

40匹の成体動物をドロップに選び出し、カバーガラスを反転させてアガロパッド上に置きます。他の各ラインについても同様に繰り返します。各ラインにつき30匹の動物をスコアリングし、各CEPおよびDニューロンの存在を確認します。

FITCまたはGFPの可視化が可能なフィルターキューブを備えたエピ蛍光共焦点顕微鏡を用い、endo G-F-P-H-Y-Qフィルターキューブを使用してデータをスコアリングシートに記録します。野生型個体では、4つのCEPニューロンと2つのADEニューロンすべてにおいて完全なGFPが保持されています。Dニューロンの消失を示す個体は、既知の野生型または変性個体としてスコアリングします。

これらのニューロンはLG（GFPの消失）として記録されます。同様に、各個体で失われたニューロンの総数を数えることで、変性の程度をスコア化することができ、また、1回あたりの系統につきさらに30匹の動物を用いて、この解析をあと2回繰り返します。

3回の解析で野生型のドーパミン作動性ニューロンを示した虫の総数を平均します。次に、学生のt検定を用いて神経保護の統計解析を行い、P値0.05未満を有意とします。対照群の虫とドーパミン作動性ニューロンで候補遺伝子を過剰発現させた系統を比較するため、産卵後のさまざまな日にこの解析を行い、適切な解析日を経験的に決定します。

例えば、alpha CLEにGFPを導入した個体のうち、それぞれ発生後6日目、7日目、10日目で77%、87%、90%にドーパミン神経細胞の変性が認められることが判明しています。したがって、目的の導入遺伝子が神経変性を促進すると予測される場合は6日目で解析を行います。同様に、神経変性を抑制すると考えられる導入遺伝子については、7日目と10日目で解析を行います。

C. elegansを用いたドーパミン神経変性アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、第一に、遺伝的交配時の選別に適切なマーカーを使用すること、第二に、交配には健康な雄およびL4期のハーミフロディト（雌雄同体）を使用することが重要です。

そして3つ目に、CEPおよびDEニューロンを注意深く、一貫してスコアリングしてください。この手順により、alpha-alpha CLEによって誘導される神経変性を促進または抑制する遺伝的因子を迅速にアッセイすることが可能になります。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。