潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

コールドウェル研究所、別名ワームシャックでは、海の優雅さにおける神経疾患のメカニズムを研究しています。そして、実りある実験の長い一日を過ごした後、私たちは自分自身に何かレクリエーション活動でご褒美をあげます。こんにちは、私はアラバマ大学生物科学部カルウェル研究所の学部生、アダム・ナイトです。

今日は、私と他の人がC Elegantsでドーパミンニューロン変性アッセイを行う方法を紹介します。ドーパミン神経変性線虫株と、候補疾患関連遺伝子およびドーパミンニューロンを過剰発現するトランスジェニック株を交配します。こんにちは、コールドウェル研究所の大学院生、アダム・ハリントンです。

今日は、ドーパミンニューロン解析のためのトランスジェニック線虫の設定方法をご紹介します。こんにちは、大学院生のShu Amichiです。ここでは、セップとエイドと呼ばれるCエレガンスのドーパミンニューロンに入るためのアッセイ方法をご紹介します。

一般に、ドーパミンニューロンでGFPのみを発現する線虫は細胞死を示さない。しかし、CLEの存在下では、それらと年齢依存性の神経変性が観察されます このアッセイを使用すると、導入遺伝子をドーパミンニューロンで共発現させて、CLE誘発毒性を増強または抑制できるかどうかを判断できます。それでは始めましょう。

ドーパミンニューロン分析を実行する前に、まず適切なGaN株を交配して、ドーパミンニューロン特異的プロモーターdatの1つの制御下でα核とGFPの両方を発現する8つのミルを配置する必要があります。次に、目的の候補遺伝子のドーパミンニューロン特異的発現を示す2つのL、4段階トランスジェニックcaアフロダイト、およびDS赤色の2つの蛍光選択マーカーの体壁筋細胞の発現を追加します。各導入遺伝子コンストラクトについて、3つの安定したトランスジェニック系統を生成することに注意することが重要です。

したがって、この遺伝的交配は、作成された3つの別々の安定系統のそれぞれに対して個別に実行する必要があります。2日後、さらに2〜3日後にオスを取り外して廃棄します。F1世代を点検します。

いくつかの男性の子孫があり、交配は成功しました。次に、雄の親から受け継いだGFP蛍光マーカーとハマディ親から受け継いだDS赤色2枚の蛍光体壁筋マーカーの両方を示す各交配から4匹ずつ、アフロディーテLから5匹ずつを新規プレートに単体移す。移送された動物は、まだM化していないことを確認するために、L4ステージにいる必要があります。

プレート上に雄の動物がいる状態で、動物が3〜4日間自家受精してF 2の子孫を産むようにします。次に、これを行うためにFの2つの子孫を掃除します。両方のセントマーカーを示す5〜10匹の動物をそれぞれのプレートに移します。

次に、動物の100%がドーパミンニューロンでGFPを発現し、一部の動物がDS red、2つの蛍光マーカー、および体壁の筋肉細胞を発現したプレートについて、F 3世代をスクリーニングします。これらの動物は、αシヌクレインとGFP遺伝子に対してホモ接合体であり、新しく作成された導入遺伝子も安定して伝達されます。スクリーニングが完了すると、ドーパミン作動性ニューロンの解析を行う準備が整います。

ニューロン解析を開始するには、前のステップで同定したF 3匹の動物の新しいプレートを準備します。3つのトランスジェニック系統のそれぞれにプレートをセットします。さらに、プレートは、コントロールとしてα-シヌクレインGFP単体株が線虫を成虫に成長させることを可能にします。

線虫が成虫になったら、各ラインから30〜40匹のトランスジェニック動物を新しいプレートに移します。摂氏20度で5時間産卵させます。5時間後、取り外して廃棄します。

成体は、胚がL4段階に達するまで、摂氏20度で3〜4日間胚を成長させます。次に、約100匹のトランスジェニックL型4匹の動物を、5つのフルオロのミリリットルあたり0.04ミリグラムを含むプレートに選びます。2つのデオキシウリジン。

このヌクレオチドアナログは、DNA合成の阻害を通じて次世代の開発を防ぎます。FDURプレートは感光性があるため、プレートを覆い隠し、完全に包んで光から保護します。ワーム分析用のAUGグロスパッドを作成します。

これらは新鮮に使用され、乾燥することはありません。テープが貼られた顕微鏡スライドを2枚セットします。縦。テープは、同等の厚さのパッドのスペーサーとして機能します。

ベンチのそれらの間に3番目のスライドを置きます。彼らは位置付けられています。3つ並んでいます。

中央側に溶融したアルスを一滴垂らし、アグロスの上に垂直な2つのスライドすべてに別のスライドをすばやく置きます。繰り返して、分析するサンプルの数に必要な数だけいくつかの追加のパッドを作成します。オーガーパッドの準備ができたら、22 x 30ミリメートルのカバーガラスに3ミリモル、11マイルの鋸、麻酔薬の6マイクロリットルのドロップを置きます。

40匹の成体動物をドロップに選び、カバーガラスをアグロスパッドにひっくり返します。他の各行についても繰り返します。各CEPニューロンとDニューロンの存在について、ラインごとに30匹の動物を採点します。

FITCまたはGFPを可視化できるフィルターキューブに落射蛍光を照射した複合顕微鏡を用いて、エンドG-F-P-H-Y-Qフィルターキューブを用いてスコアリングシートにデータを記録します。野生型動物は、4つのCEPニューロンすべてと2つのA DEニューロンのレッスンのために完全なGFPを保持しています。Dニューロンの喪失を示す個々の動物は、既知の野生型または縮退性として採点されます。

これらのニューロンは、LGまたはGFPの喪失として記録されます。同様に、変性の程度は、各動物で失われたニューロンの総数を数えることによってスコアリングでき、集団は分析をさらに2回繰り返す。試行ごとにラインごとに30匹以上の動物を使用します。

3回の解析から野生型ドーパミンニューロンを示す線虫の総数を平均化します。次に、神経保護の統計分析は、学生の T 検定 P 値が 0.05 未満を使用して実行されます。ドーパミンニューロンで候補遺伝子を過剰発現する株と対照線虫を比較するために、卵レーンに続くさまざまな日のこの分析を行い、分析の適切な日を経験的に決定しました。

例えば、α CLEとGFPを併用した動物の77%87%と90%が、それぞれ発生後6日目、7日目、10日目に変性したドーパミンニューロンを示すことを決定しました。したがって、対象の導入遺伝子が神経変性を促進する可能性があると予測した場合、6日目に分析します。同様に、神経変性を抑制する可能性のある導入遺伝子は、7日目と10日目に分析されます。

私たちはちょうど海の優雅さでドーパミン神経変性アッセイを実行する方法を示しました。この手順を実行するときは、遺伝的交配中の選択に適切なマーカーを使用することを覚えておくことが重要です。2つ目は、健康な男性を使用し、十字架にはL 4 HEDISを使用します。

そして3つ目は、CEPとDEニューロンを慎重かつ一貫してスコアリングするようにすることです。この手順により、α alpha CLE誘発性神経変性を増強または抑制する可能性のある遺伝的因子を迅速にアッセイすることができます。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。