C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

こんにちは。アラバマ大学生物科学科のCaldwell研究室のCody Lockeです。Kyle Leeです。ここでは、outta carbおよびPTZ曝露アッセイのための線虫の調製方法を説明します。Bernard Tuです。out carbアッセイの実施方法を実演します。

私はKaylin Berryです。C. elegansのビデオ制作を担当しています。本プレゼンテーションでは、ナレーションとともにPTZ曝露アッセイの実演を行います。本日は、同僚と共に、一連の代表的な変異株を用い、PTZおよびアルデカルブに曝露させた後のてんかんモデルC. elegansにおいて、シナプス伝達変異体をどのように特性評価するかについて説明します。

それでは始めましょう。まずKyle Leeが、本手順の1日目に行うALD carbアッセイの準備について説明します。2日目のALD carbアッセイに向けて、各ジェノタイプおよび各リプリケートにつき、少なくとも30匹の若成体期の虫を確保してください。

実験者は、餌としてe coli OP 50を播種した、殺菌剤を含まない新鮮なNGMプレートに、L4期の虫体を50匹以上選別して移すことが推奨されます。その後、一定かつ許容温度で12〜24時間培養します。20 °Cから22 °Cが最適ですが、25 °Cでも許容可能です。

2日目に、100 mMのAl Decarbストック溶液と70%エタノールを調製し、適切な量のAl DecarbをNGMプレートに塗布します。当社では、7.5 mLのNGMを含む60 mmの非通気性ペトリ皿に、100 mM Al Decarbを37.5 µL分注することで、一貫して0.5 mMのAl Decarbを使用しています。Al Decarbを塗布したプレートを室温で約30〜60分間乾燥させます。

プレートが乾燥した後、蓋を割る必要はありません。各alde carbプレートの中央に一定量のe coliを滴下し、さらに30～60分間乾燥させます。室温では、通常25 µLのe coli OP 50を添加します。

この量のOP 50を用いることで、十分なサイズの餌用菌叢（フードローン）が形成され、線虫を過密状態にすることなく、プレート中央の狭い範囲に維持できます。餌用菌叢が乾燥したら、アルバカルバアッセイに進みます。ALDカルバアッセイは主観的な判断が含まれるため、実験はブラインド法で実施することを強く推奨します。

この操作を行うため、主実験者の同僚が、アッセイ対象の線虫を含む元のプレートにラベルを貼り直すか、あるいはタイマーを開始する直前に、元のプレートからcipher alde carbプレートに線虫を移します。プレートの準備が整ったところで、麻痺した線虫の数を数えて解析を開始します。

急性al脱炭酸誘導性麻痺を定義するための主要なアプローチは2つあります。1つ目のアプローチでは、咽頭ポンプの停止によって麻痺を定義します。このビデオノートでは、画面右側の線虫の咽頭腔内に位置する暗い構造物が示されています。

この構造はグラインダーと呼ばれ、コリン作動性メカニズムを通じて律動的に収縮します。このビデオにおける線虫の移動速度は、Al Decarbへの曝露により大幅に低下しています。しかし、この線虫の咽頭グラインダーは依然として明確に動いています。

したがって、この虫はポンプ機能の停止という定義による麻痺状態にはありません。このビデオでは、画面右側に位置する咽頭グラインダーが収縮していないことを確認してください。al Decarb誘発性麻痺の作業定義における「ポンプ機能の停止」に基づけば、この虫は麻痺していると判定されるべきです。

しかしながら、前回のビデオに登場した個体と同様に、この個体もわずかに左右に採餌行動のような動きを見せています。Al Decarbによって運動能力が損なわれているにもかかわらず、このような動きがあるため、Al Decarb誘発性麻痺を定義する第2のアプローチである「全身の不動および刺激への無反応」に基づけば、実験者はこの個体を麻痺しているとは判断しないことになります。Al Decarb誘発性麻痺を定義する第2のアプローチでは、白金線で各個体を一貫して刺激し、反応を確認します。

肉眼で身体の動きが確認できない場合、推奨されるアプローチは、30分ごとに頭部を2回、尾部を2回刺激し、これを合計3時間行うことです。ビデオでご覧の通り、このウォームは身体を明らかに動かしていません。それにもかかわらず、このウォームは刺激に対して尾部を明確に動かして反応するため、麻痺しているとは判断しません。

al decarb誘発性麻痺の2番目の定義による例です。前のビデオの虫と同様に、この虫は明らかに体を動かしていないため、刺激テストが必要です。しかし、前のビデオの虫とは異なり、この虫は刺激に対して明確に反応しません。

したがって、この線虫はal decarb誘発性麻痺の2番目の定義によって麻痺していることになります。al decarbによる麻痺の有無の差はわずかである場合がありますが、al decarbプレートにピックアップした直後に大量の代表的な線虫を観察することで、実験者は実質的な変化とシナプス伝達を識別できるはずです。野生型線虫は依然として可動しています。

このビデオでは、前回のビデオに登場したのと同じ野生型蠕虫を、Al Decarbに1時間曝露させた後の状態で観察します。蠕虫はある程度速度が低下していますが、依然として明らかに動いていることに注目してください。

野生型の線虫とは異なり、本ビデオに登場するtomasin 1変異体は、1時間の曝露後、完全に不動となるか、あるいはほとんど動かなくなります。この結果は、tomasin 1変異体が神経筋接合部における神経伝達物質放出の負の調節能を欠いているため、アセチルコリンが過剰に分泌されることと一致しています。神経筋接合部のシナプス間隙におけるアセチルコリンの過剰存在と、アセチルコリン分解の阻害（Bial Decarbによる）が組み合わさることで、tomasin 1変異体は過敏になります。ここでは示していませんが、C. elegansのcalmodulin依存性プロテインキナーゼ2のオーソログをコードするunc-43の機能喪失アレルを用いたalde carbアッセイにおいても、同様の結果が生じると仮定されています。本ビデオでは、抑制性GABA作動性伝達に欠損があるunc-25変異体についても示します。

1時間のal Decarb曝露後、tomasin-1およびM 43変異体と同様に、これらの変異体はal Decarbによって誘発される顕著な運動機能障害を示し、同時間al Decarbに曝露した野生型虫よりも影響を強く受けていると考えられます。この結果は、M 25変異体において、al Decarb曝露とGABA作動性伝達の減少が組み合わさることで体壁筋が過剰刺激され、CELs神経筋接合部における興奮性対抑制性伝達比が増大し、その結果として麻痺が引き起こされることと一致しています。しかしながら、tomasin-1、M 43、およびM 25変異体は、この時点においてal Decarbに対して同様の感受性を示します。

体壁筋の過剰刺激の原因は異なるものの、原因となる変異体の正体をまず特定しなければ、実験者は過敏性の根底にあるメカニズムを知ることはできません。このビデオでは、以前のビデオに登場した野生型線虫を用い、ALD carbに3時間曝露させた時点での様子を確認します。このALD carbアッセイの最終時点において、これらの線虫は野生型であるにもかかわらず、完全に不動であるか、あるいはかろうじて動いている状態であることが明確に見て取れます。これらの線虫は、ALD carb曝露1時間後に示したTOM-1およびM25変異体と表現型が類似しており、これはおそらく興奮性コリン作動性伝達が同レベルに達したためと考えられます。対照的に、Synap Bren-1変異体はALD carbに3時間曝露した後でも、かなりの可動性を維持しています。

この結果は、正常なレベルの神経伝達物質放出を欠くSynaptive Bren one変異体が、同レベルのalde carb曝露後において、野生型虫よりもボディウォール筋肉でのコリン作動性刺激が少ないことと一致しています。コリン作動性伝達に特異的な欠損を持つPoint on four変異体は、Synaptive Bren one変異体と同様のAl Decarbに対する感受性を示すはずです。逆に、Tomasin oneおよびO 25過剰感受性変異体は、野生型虫と同様に麻痺したままとなります。

一部の線虫、特にAl Decarbに耐性を持つ個体は、プレートの外へ這い出そうとする場合があることに注意してください。このような場合、線虫の移動を妨げる物理的障壁として、一定量のパルミチン酸を塗布することができます。Al Decarbプレートの周囲に、10 mg/mLのパルミチン酸/エタノール溶液を25 µL塗布しました。

これでAl Decarb曝露パラダイムは終了です。次に、Penta Lean Terazol曝露パラダイムを実演します。PTZアッセイについては、Kaylin Berryがサポートします。

PTZアッセイのための線虫の準備は、基本的にアルデヒドカルボニルアッセイ（alde carb assays）のための準備と同様です。これら2つのアッセイの主な違いは以下の点のみです。PTZの溶媒として70% ethanolの代わりにDDH two Oを使用します。

また、PTZはALDE carbよりも大量に播種することが多いため、OP 50を添加する前にプレートを少なくとも1時間乾燥させます。PTZにはパルミチン酸を使用することも可能です。また、PTZはalde carbよりもはるかに不安定であり、-20°Cで保存する必要があることに注意してください。

解析を開始するために、1時間にわたり30分ごとに、てんかん様の光誘発性痙攣を起こしているワームの数をカウントします。痙攣のタイプ別に、全身痙攣、前方痙攣（ヘッドボブと呼ぶ）、前方痙攣と体壁筋麻痺の組み合わせ（強直間代と呼ぶ）、または全身麻痺（強直と呼ぶ）などの個別のカテゴリーに分けてスコアを付けるのが最適です。右側のワームに見られるような発作様活動は、多くの場合、左側のワームに見られるような強直間代痙攣の後に起こります。

発作のような活動は、単に反復的な強直間代性痙攣に続く筋肉疲労の結果である可能性があります。しかし、我々の未発表データでは、一部の虫が、以前に強直間代性痙攣を起こしていない状態で、al decarb誘導麻痺と同様の方法でPTZにより強直状態になることが示されています。ここでは、代表的なシナプス伝達変異虫が、各種の発作およびてんかん動物モデルにおける一般的な発作誘発剤でありGABA受容体アンタゴニストであるPTZが存在しない状態で這っている様子を示します。

虫が採餌している間、先端または鼻の部分が左右に振れていることに注目してください。このビデオでは、前のビデオで使用したものと同じシナプス伝達変異株の別の虫を示します。2.5 mg/mLのPTZを含む水の中にいるこの虫は、採餌中にほとんどの場合、頭を左右に動かし続けていることがわかります。

しかし、この線虫は時折、左右への探索行動を停止し、代わりに前方を繰り返し突き出す動作を見せます。最後に、前の2つのビデオと同じ変異を持つ線虫を、10 mg/mLのPTZを含む水に曝露させた様子を確認します。この線虫は、左右への探索行動が減少しており、PTZの濃度が低い時よりも高い頻度と強度で前方を突き出していることに注目してください。

これらの結果は、PTZの用量依存性を示すものであり、これはすべてのPTZ感受性シナプス伝達変異体において観察されます。重要な点として、野生型虫へのPTZ曝露だけでは、てんかん様痙攣を誘発するには不十分です。同様に、cholinergic伝達に特異的な欠損を持つ虫（fourなど）や、cholinergic伝達が過剰な虫（tomasin oneなど）においても、PTZ誘発性のてんかん様痙攣を試みましたが、観察されませんでした。

したがって、PTZに対する相対的な感受性に基づいて、アルデヒドカルボン酸耐性を有するシナプス伝達変異体を、一般的なシナプス機能の欠損によるものか、あるいはコリン作動性伝達の特異的な欠損によるものかで、さらに特性評価することが可能であると考えられます。意外かもしれませんが、C. elegansの抑制性運動ニューロンにおいて検出可能なGABA発現を欠く、機能が著しく低下したONC 25変異体では、このビデオに見られるような自発的なてんかん様痙攣は認められません。

10 mg/mLのPTZ（水溶液）を投与したONC 25変異体において、頑健な強直間代痙攣が認められました。ただし、図示されていないものの、ONC 25に関連する強直間代痙攣に先立って、わずかな動きを伴う前部のみの痙攣が発生し、これはsynap Bren 1変異体の痙攣に類似していました。したがって、実験者は、特にハイポモルフィック（機能低下）な変異対立遺伝子が得られる可能性を考慮し、すべての抑制性GABA変異体がPTZ存在下で強直間代痙攣またはそれに密接に関連する強直性てんかん様活動を示すと想定すべきではありません。

抑制性GABA変異体ではalde carbおよびPTZに対して過敏性を示し、一方でコリン作動性伝達の負の調節を欠く変異体ではalde carbに対してのみ過敏性を示しPTZに対しては通常の感受性を示すことが実証されました。そこで、他のシナプス伝達変異体と同様にalde carbに対して過敏であるUNC 43機能喪失変異体が、PTZに対してどのような反応を示すかという疑問が生じます。UNC 43変異体は、PTZがない状態では明らかなてんかん様の痙攣を示しません。ただし、これらの変異体では稀に非反復性ではあるものの自発的な全身収縮が見られます。しかし、10 mg/mLのPTZ水溶液に曝露させると、UNC 43機能喪失変異体は、強固で反復的な、用量依存的な全身痙攣を呈します。現時点では、これらの結果は曖昧ですが、UNC 43が抑制性GABA作動性伝達において特定の役割を持っていないか、あるいは神経伝達物質放出の負の調節においてのみ役割を担っていることを示唆していると考えられます。

C. elegansの神経系において、相補的な神経刺激剤であるコリンエステラーゼ阻害剤のAldicarbおよびGABA受容体拮抗薬のPTZを用いて、CL elganシナプス伝達変異体を特性評価する方法を説明しました。相補的な薬理学的パラダイムに従う際は、一方の神経刺激剤に対する感受性の程度から、もう一方の神経刺激剤に対する感受性の程度を予測することはできないという点に留意してください。Aldicarbアッセイを利用することで、PTZでヘッドボビング（head bob）を示すがAldicarbに超感受性である抑制性GABA変異体と、同じくPTZでヘッドボビングを示すがAldicarbに耐性を持つ全般的なシナプス機能不全変異体を区別できるはずです。さらに、抑制性GABA変異体はPTZでヘッドボビングを示す一方で、コリン作動性伝達の負の制御を欠く虫は、PTZにおいて野生型と同様に見えることを理解しておく必要があります。

したがって、PTZアッセイを用いることで、どちらもAlde carbに対して高感度であるこれら複数のクラスのシナプス伝達変異体を区別することが可能です。要約すると、PTZおよびAlde carbアッセイによる相補的なアプローチを用いることで、いずれか一方の薬剤のみでは不可能な方法でC. elegansのシナプス伝達変異体を特性解析できると考えられます。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。