Name: C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-18T17:08:00.000+00:00
Duration: 18 min 1 s
Description: 学ぶ C. elegansを用いたシナプス伝達変異体の薬理学的特性評価法。アルジカーブとPTZの相補的アプローチにより、神経同期の進化的保存メカニズムとてんかん発作の理解に貢献します。

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我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ダイムの月からバジルオコナーScholarの賞と全米科学財団からGACへのキャリア賞だけでなく、ハワードヒューズ医学研究所からのアラバマの大学に学部研究科学プログラムグラント、神経細胞の興奮性に資金を提供しているとコー​​ルドウェルラボにおけるてんかんの研究。

アルジカルブの露出パラダイム<ol><li>初日には、各遺伝子型のと、各レプリケートのうち少なくとも30人の若い成人舞台のワームは、二日目アルジカルブアッセイのための利用可能になることを確認してください。実験者はE.を含む新鮮なNGMプレート上に50歳か以上のL4段階のワームを（最高のナイスタチンなし）、選択された場合、それがベストです食物源としての大腸菌 （できればOP50）、と（20 ° C 22〜25℃は大丈夫ですが° Cは、最適な）一貫性があり、許容温度で12-24時間のためにそれらを成長する。 </li><li>二日目に、70％エタノール（EtOH）および30％のddH 2 Oでアルジカルブの100mMのストック溶液を作る希望アルジカルブの濃度を達成するために定義されたボリュームとNGMマイナスナイスタチンプレート上にアルジカルブの適切な量を広げる。我々は一貫して7.5 mLのNGMプレート上にめっきによって100mMのアルジカルブの37.5μLを0.5 mMのアルジカルブを使用してください。アルジカルブプレートは室温でおよそ30〜60分間乾燥することができます。それは蓋をクラックする必要はありません。また、アルジカルブはNGMに加え、4℃で一週間保存できます。 &nbsp;</li><li> E.の乾燥後、プレート一貫性のあるボリューム各アルジカルブプレートの中心と室温でさらに30〜60分間乾燥した上に大腸菌 （できれOP50）。過密なく、小さなスポットに集中してワームを保つために十分なサイズの食品の芝生を作成する私たちは常に板OP50の25μLを、。 &nbsp;</li><li>食品の芝生が乾燥しているとき、人はアルジカルブアッセイを進めることができます。アルジカルブアッセイの主観的な性質のため、それは非常に実験は&quot;盲目的に&quot;実行することをお勧めします。主実験者の同僚は、定量するワームで、オリジナルのプレートを付け直すことができます。同様に、同僚は、タイマーを開始する前にすぐに暗号化さアルディカーブプレートにオリジナルのプレートからワームを転送することができます。実験者がそのようなuncoordinationなどの特徴的な表現型を持つワームの特定の株をアッセイ予想した場合、その後にもバイアスを減らすために類似の表現型を持つコントロールが存在する必要があります。さらに、それは実験の標準化を支援するために並行して、実験者は、アッセイ野生型株だけでなく、耐性株と過敏性ひずみを場合に最適です。実験者は、各複製のためのワームの一貫性のある数を分析するために努力すべきである。私たちは常に、各レプリケートするための単一の遺伝子型三十ワームを分析する。我々はまた、少なくとも3つを実行すると、各実験のために複製されます。経験豊富な実験者が一度に少なくとも6つの系統を分析することができるはずです。 &nbsp;</li><li>白金線で一貫した方法で各ワームをつついによって麻痺したワームの数を数えます。我々は一貫して二回頭の上と二回尾三時間の合計は30分ごとに私たちのワームを突く。ポンピング咽頭の停止も麻痺を定義するために使用されるが、実験者は、すべてのアッセイ上麻痺の一貫した定義を採用している場合にのみすることができます。また、それは特に、いくつかのワーム、アルジカルブに耐性があるものは、プレートをオフクロールしようとする場合があることは注目に値する。このケースでは、実験者はアルディカーブプレートの周りに、パルミチン酸、ワームの運動への物理的な障壁の一貫性のある量を広げることができる。我々は10 mgパルミチン酸/ mLのエタノールの25μLを広げる。 </li></ol> PTZ露出パラダイム<ol><li>初日には、各遺伝子型のと、各レプリケートのうち少なくとも30人の若い成人舞台のワームは、二日目のPTZアッセイのための利用可能になることを確認してください。実験者はE.を含む新鮮なNGMプレート上に50歳か以上のL4段階のワームを（最高のナイスタチンなし）、選択された場合、それがベストです食物源としての大腸菌 （できればOP50）、と（20 ° C 22〜25℃は大丈夫ですが° Cは、最適な）一貫性があり、許容温度で12-24時間のためにそれらを成長する。 </li><li>二日目には、PTZ 0.5gのPTZ / mLののddH 2 Oのストック溶液を作る。希望するPTZ濃度を達成するために定義されたボリュームとNGMマイナスナイスタチンプレート上にPTZの適切な量を広げる。我々は7.5 mLのNGMプレート上にPTZの量を変えPTZ、我々プレートの用量反応アッセイを好むので。たとえば、あるは7.5 mLのNGMプレート上にプレートPTZストック溶液の37.5μLを5 mgのPTZ / mLの溶液を作成することがあります。 PTZプレートは室温でおよそ60〜120分間乾燥することができます。それは蓋をクラックする必要はありません。また、PTZはNGMに直接追加することができますが、それはすぐに凝固した後、アッセイに使用する必要があります。 PTZの安定性はアルジカルブの場合よりもかなり少なくなります。したがって、古いPTZプレートとアッセイは信頼性が低い。 PTZは、使用前に乾燥剤をデシケーター中で-20℃で保存してください。我々は安定性を確保するために、開封後約2ヶ月PTZを破棄することを好む。 </li><li> E.の乾燥後、プレート一貫性のあるボリューム大腸菌 （できれOP50）各PTZプレートの中央に、室温で別の30〜60分間乾燥した。過密なく、小さなスポットに集中してワームを保つために十分なサイズの食品の芝生を作成する私たちは常に板OP50の25μLを、。 &nbsp;</li><li>食品の芝生が乾燥しているとき、人はPTZアッセイを進めることができます。 PTZアッセイはアルジカルブのアッセイよりも主観的ですが、それはまだ非常に実験は&quot;盲目的に&quot;実行することをお勧めします。主実験者の同僚は、定量するワームで、オリジナルのプレートを付け直すことができます。同様に、同僚は、タイマーを開始する前にすぐに暗号化さPTZプレートにオリジナルのプレートからワームを転送することができます。実験者がそのようなuncoordinationなどの特徴的な表現型を持つワームの特定の株をアッセイ予想した場合、その後にもバイアスを減らすために類似の表現型を持つコントロールが存在する必要があります。さらに、それは実験の標準化を支援するために並行して、実験者のアッセイ野生株だけでなく、前方または全身痙攣を有する株場合に最適です。実験者は、各複製のためのワームの一貫性のある数を分析するために努力すべきである。私たちは常に、各レプリケートするための単一の遺伝子型三十ワームを分析する。我々はまた、少なくとも3つを実行すると、各実験のために複製されます。経験豊富な実験は、一度に少なくとも3つの株を分析することができるはずです。ワームが麻痺になったり、場合によっては、薬剤に慣らしとしてはまだ、その後周波数と強度の暴露の15〜30分間の間に通常のピークPTZ誘発性痙攣の、とは減衰。 </li><li>一時間の合計のための&quot;てんかんのような&quot;ワームをconvul​​sing 30分ごとの数を数えます。それは、フルボディの痙攣、全身麻痺、我々は&quot;トニック&quot;と呼ぶ、または組み合わせでワームの数とは別に、我々は&quot;頭ボブ&quot;と呼ぶ前痙攣、とワームの数を獲得するのが最適です我々は、&quot;強直間代&quot;と呼ぶBWM麻痺と前方痙攣、。単一の遺伝子型のほとんどのワームは、痙攣の1種類のみを示す。しかし、強直間代ワームは、しばしば完全に強壮剤になるので、一つはすべてのワームはすでに痙攣を展示している場合でも、30分を過ぎて分析を続ける必要があります。また、それはいくつかのワームは、プレートをオフクロールしようとする場合があることは注目に値する。このケースでは、実験者はPTZプレート周りのパルミチン酸の一貫性のある量を広げることができる。我々は10 mgパルミチン酸/ mLのエタノールの25μLを広げる。 </li></ol>アルジカルブ及びPTZに選択された線虫のシナプス伝達の変異体の行動反応<table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th>変異体名</th><th>シナプスの役割</th><th>薬物なしで動作</th><th>アルジカルブの行動反応（野生型N2に比べて） </th><th> PTZに対する行動反応</th></tr><tr><td>トム- 1（ok188） </td><td>シナプス伝達を抑制する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の増強率</td><td>野生型と区別できない</td></tr><tr><td> UNC - 43（n498n1186） </td><td>複雑</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の増強率</td><td>全身痙攣</td></tr><tr><td> UNC - 25（e156） </td><td> GABA伝達を促進する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の増強率</td><td>前痙攣、全身麻痺</td></tr><tr><td> SNB - 1（md247） </td><td>シナプス伝達を促進する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の減少率</td><td>前痙攣</td></tr><tr><td> UNC - 4（E120） </td><td>アセチルコリン伝達を促進する</td><td>まとまりのない</td><td>麻痺の減少率</td><td>野生型と区別できない</td></tr></tbody></table>ペンチレンテトラゾール（PTZ）と呼ばれる2つのニューラル覚醒剤、アルジカルブと呼ばれるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、およびGABA受容体拮抗薬は、、C. elegansのシナプス伝達の変異体を特徴づけるために相補的に使用することができます。過剰興奮性アセチルコリン（ACH）はAChの伝達（例えばタム- 1、UNC - 43）または抑制性GABA伝達（例えば、UNC - 25）の正の調節因子の負の調節に有害な突然変異からワーム体壁筋接合部（NMJs）に蓄積する。逆に、ワームのNMJsにおける興奮性AChのレベルは、一般的なシナプス伝達（例えば、SNB - 1）またはACH -特定の送信の遺伝子（例えば、UNC - 4）の正電圧レギュレータで、有害な突然変異によって減少する。低下興奮性AChの伝達と変異型ワームは、アルディカーブに誘導される麻痺の減少率を示すのに対し、野生型N2のワームと比較すると、NMJsで上昇興奮性AChの伝達と変異体のワームは、アルディカーブに誘導される麻痺の増強率を示す。 PTZはないアルジカルブとは異なり、線虫体壁筋で神経同期を中断しますが、PTZもC. elegansの頭部の筋肉に抑制GABAに拮抗する。その結果、アルジカルブの感度は、正確にPTZの感受性を予測することはできません。負または正のregul内の特定の欠陥を持つ変異体ワームアセチルコリン伝送の評価作業を容易には一般的なシナプス伝達または抑制性GABA伝達の展示堅牢なPTZ誘発性前部痙攣で特定の欠陥の正の調節に欠陥を持つ変異体ワームのに対し、PTZの存在下で野生型N2のワームから区別することはできません。また、UNC - 43の機能喪失変異体は、PTZの存在下で、フルボディの痙攣を表示し、おそらく彼らのユニークな薬剤応答に寄与する追加のシナプス伝達の異常を、持っている。

<ol><li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li>
<li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet.%22%5BJournal%5D)">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li>
</ol>

C.とアルジカルブ露出のための現在のプロトコル虫は、変異体の両方のクラスはアルジカルブに耐性を示すように実験者は、シナプス伝達における一般的な赤字とAChの伝達と変異体の特定の障害を持つ変異体を区別することはできません。同様に、アルジカルブは、変異体は変異の両方のクラスはアルジカルブに過敏症を示すように否定的に、アセチルコリンの伝達を調節するためにGABA伝達または一般的な障害で特定の障害を持っているかどうかを判断するために使用することはできません。アルジカルブ露出アッセイからの結果と組み合わせて私たちのPTZの曝露アッセイからの結果は、、研究者がよりよいシナプス伝達の変異体を特徴づけることができます。 C. elegansのシナプス伝達の変異体を相補アルジカルブ及びPTZの曝露のパラダイムで簡単な方法で分類される可能性があります。 PTZ誘発性前部痙攣とアルジカルブ耐性変異体は、一般的なシナプス機能の可能性が不足しています。逆に、PTZ誘発性前部痙攣なしアルジカルブ耐性変異体は、アセチルコリンの伝達に可能性が特に不足しています。 PTZ誘発性前方痙攣を示さないアルジカルブ過敏症、ある変異体は、おそらく否定...

<table><tbody><tr><td>アルジカルブ</td><td>試薬</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>PS734</td><td>Sigmaから購入可能</td></tr><tr><td>ペンチレンテトラゾール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

線虫、線虫（Caenorhabditis elegans）は、神経伝達を研究するための方便モデルとなっている。その神経系の解剖学との接続は電子顕微鏡写真から決定および薬理学的アッセイによって洗練されているようにC. elegansは、動物モデルの中で一意です。このビデオでは、我々は、どのように2つの補完的な神経刺激剤アルジカルブと呼ばれるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を、記述し、ペンチレンテトラゾール（PTZ）と呼ばれるγ-アミノ酪酸（GABA）受容体拮抗薬は、、特にC. elegansの神経筋接合部での信号の特性評価に用いることができる（NMJs）と拮抗神経回路の我々の理解を促進する。 302 C. elegansのニューロン、19 GABA作動性D -型運動ニューロン神経支配の体壁の筋肉（BWMS）、の間RMEsと呼ばれる4つのGABA作動性ニューロン、、支配する頭の筋肉。逆に、三十から九運動ニューロンは、興奮性神経伝達物質、アセチルコリン（ACH）を発現し、運動を調整するBWMSでGABA伝達を拮抗する。体壁のNMJsにおけるGABA作動性およびコリン作動性運動ニューロンの拮抗性質は、最初にレーザーアブレーション法によって決定され、後でアルジカルブの曝露によってbuttressedした。時間の経過または野生型ワームにおいて用量反応性の麻痺の急性アルジカルブの暴露の結果。以下アセチルコリンがBWMSの少ない刺激につながる、ワームのNMJsで蓄積として、まだ、興奮性AChの伝送の損失は、アルジカルブに耐性を付与する。アルジカルブへの抵抗は、アセチルコリン固有のまたは一般的なシナプス機能の変異体で観察されることがあります。拮抗GABAおよびアセチルコリン伝達、GABA伝達の損失、または否定的にアセチルコリン放出を調節することが失敗と一致し、アルジカルブに過敏性を付与する。アルジカルブの曝露は神経伝達遺伝子の多数のワームのホモログの単離につながっているものの、アルジカルブの露出だけでは効率的に特定の線虫C. elegansの運動神経細胞の遺伝子とパスウェイのための支配的役割を決定することはできません。この目的のために、我々は、PTZを使用して補完的な実験的アプローチを、導入している。 神経伝達変異体は、PTZに対応しアルディカーブ誘導の麻痺とは異なる明確な表現型を、、が表示されます。野生型ワームだけでなく、アセチルコリンを放出または受信する場合は、特定の無能と変異体は、PTZに明らか感度を示していない。しかし、GABAの変異体、ならびに一般的シナプス機能の変異体は、時間経過や用量反応性の形で前方痙攣が表示されます。否定的に一般的な神経伝達物質の放出を調節し、従って、BWMSにアセチルコリンの過剰な量を分泌できない変異体は、PTZに麻痺する。離散的変異体のクラスのPTZ誘発性表現型は、C. elegansのアルジカルブ及びPTZ露出パラダイムと相補的なアプローチは、神経伝達の我々の理解を加速させる可能性があることを示している。また、我々は薬理学的アッセイを行う方法をデモビデオはC. elegansの研究のための一貫性のある方法を確立する必要があります。

このビデオでは、線虫、C. elegansのシナプス機能を研究するために補完的な方法で2つのニューラル覚せい剤、アルジカルブとペンチレンテトラゾール（PTZ）を、採用する方法を示します。この補完的なアプローチは、変調神経同調のための進化的に保存のメカニズムに光を当てると、てんかんと発作のための意味を持つために使用することができます。

C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

線虫であるCaenorhabditis elegansは、神経伝達の研究において便利なモデル生物となっています。C. elegansは動物モデルの中でも特異であり、...

こんにちは。アラバマ大学生物科学科のCaldwell研究室のCody Lockeです。Kyle Leeです。ここでは、outta carbおよびPTZ曝露アッセイのための線虫の調製方法を説明します。Bernard Tuです。out carbアッセイの実施方法を実演します。私はKaylin Berryです。C. elegansのビデオ制作を担当しています。本プレゼンテーションでは、ナレーションとともにPTZ曝露アッセイの実演を行います。本日は、同僚と共に、一連の代表的な変異株を用い、PTZおよびアルデカルブに曝露させた後のてんかんモデルC. elegansにおいて、シナプス伝達変異体をどのように特性評価するかについて説明します。それでは始めましょう。まずKyle Leeが、本手順の1日目に行うALD carbアッセイの準備について説明します。2日目のALD carbアッセイに向けて、各ジェノタイプおよび各リプリケートにつき、少なくとも30匹の若成体期の虫を確保してください。実験者は、餌としてe coli OP 50を播種した、殺菌剤を含まない新鮮なNGMプレートに、L4期の虫体を50匹以上選別して移すことが推奨されます。その後、一定かつ許容温度で12〜24時間培養します。20 °Cから22 °Cが最適ですが、25 °Cでも許容可能です。2日目に、100 mMのAl Decarbストック溶液と70%エタノールを調製し、適切な量のAl DecarbをNGMプレートに塗布します。当社では、7.5 mLのNGMを含む60 mmの非通気性ペトリ皿に、100 mM Al Decarbを37.5 µL分注することで、一貫して0.5 mMのAl Decarbを使用しています。Al Decarbを塗布したプレートを室温で約30〜60分間乾燥させます。プレートが乾燥した後、蓋を割る必要はありません。各alde carbプレートの中央に一定量のe coliを滴下し、さらに30～60分間乾燥させます。室温では、通常25 µLのe coli OP 50を添加します。この量のOP 50を用いることで、十分なサイズの餌用菌叢（フードローン）が形成され、線虫を過密状態にすることなく、プレート中央の狭い範囲に維持できます。餌用菌叢が乾燥したら、アルバカルバアッセイに進みます。ALDカルバアッセイは主観的な判断が含まれるため、実験はブラインド法で実施することを強く推奨します。この操作を行うため、主実験者の同僚が、アッセイ対象の線虫を含む元のプレートにラベルを貼り直すか、あるいはタイマーを開始する直前に、元のプレートからcipher alde carbプレートに線虫を移します。プレートの準備が整ったところで、麻痺した線虫の数を数えて解析を開始します。急性al脱炭酸誘導性麻痺を定義するための主要なアプローチは2つあります。1つ目のアプローチでは、咽頭ポンプの停止によって麻痺を定義します。このビデオノートでは、画面右側の線虫の咽頭腔内に位置する暗い構造物が示されています。この構造はグラインダーと呼ばれ、コリン作動性メカニズムを通じて律動的に収縮します。このビデオにおける線虫の移動速度は、Al Decarbへの曝露により大幅に低下しています。しかし、この線虫の咽頭グラインダーは依然として明確に動いています。したがって、この虫はポンプ機能の停止という定義による麻痺状態にはありません。このビデオでは、画面右側に位置する咽頭グラインダーが収縮していないことを確認してください。al Decarb誘発性麻痺の作業定義における「ポンプ機能の停止」に基づけば、この虫は麻痺していると判定されるべきです。しかしながら、前回のビデオに登場した個体と同様に、この個体もわずかに左右に採餌行動のような動きを見せています。Al Decarbによって運動能力が損なわれているにもかかわらず、このような動きがあるため、Al Decarb誘発性麻痺を定義する第2のアプローチである「全身の不動および刺激への無反応」に基づけば、実験者はこの個体を麻痺しているとは判断しないことになります。Al Decarb誘発性麻痺を定義する第2のアプローチでは、白金線で各個体を一貫して刺激し、反応を確認します。肉眼で身体の動きが確認できない場合、推奨されるアプローチは、30分ごとに頭部を2回、尾部を2回刺激し、これを合計3時間行うことです。ビデオでご覧の通り、このウォームは身体を明らかに動かしていません。それにもかかわらず、このウォームは刺激に対して尾部を明確に動かして反応するため、麻痺しているとは判断しません。al decarb誘発性麻痺の2番目の定義による例です。前のビデオの虫と同様に、この虫は明らかに体を動かしていないため、刺激テストが必要です。しかし、前のビデオの虫とは異なり、この虫は刺激に対して明確に反応しません。したがって、この線虫はal decarb誘発性麻痺の2番目の定義によって麻痺していることになります。al decarbによる麻痺の有無の差はわずかである場合がありますが、al decarbプレートにピックアップした直後に大量の代表的な線虫を観察することで、実験者は実質的な変化とシナプス伝達を識別できるはずです。野生型線虫は依然として可動しています。このビデオでは、前回のビデオに登場したのと同じ野生型蠕虫を、Al Decarbに1時間曝露させた後の状態で観察します。蠕虫はある程度速度が低下していますが、依然として明らかに動いていることに注目してください。野生型の線虫とは異なり、本ビデオに登場するtomasin 1変異体は、1時間の曝露後、完全に不動となるか、あるいはほとんど動かなくなります。この結果は、tomasin 1変異体が神経筋接合部における神経伝達物質放出の負の調節能を欠いているため、アセチルコリンが過剰に分泌されることと一致しています。神経筋接合部のシナプス間隙におけるアセチルコリンの過剰存在と、アセチルコリン分解の阻害（Bial Decarbによる）が組み合わさることで、tomasin 1変異体は過敏になります。ここでは示していませんが、C. elegansのcalmodulin依存性プロテインキナーゼ2のオーソログをコードするunc-43の機能喪失アレルを用いたalde carbアッセイにおいても、同様の結果が生じると仮定されています。本ビデオでは、抑制性GABA作動性伝達に欠損があるunc-25変異体についても示します。1時間のal Decarb曝露後、tomasin-1およびM 43変異体と同様に、これらの変異体はal Decarbによって誘発される顕著な運動機能障害を示し、同時間al Decarbに曝露した野生型虫よりも影響を強く受けていると考えられます。この結果は、M 25変異体において、al Decarb曝露とGABA作動性伝達の減少が組み合わさることで体壁筋が過剰刺激され、CELs神経筋接合部における興奮性対抑制性伝達比が増大し、その結果として麻痺が引き起こされることと一致しています。しかしながら、tomasin-1、M 43、およびM 25変異体は、この時点においてal Decarbに対して同様の感受性を示します。体壁筋の過剰刺激の原因は異なるものの、原因となる変異体の正体をまず特定しなければ、実験者は過敏性の根底にあるメカニズムを知ることはできません。このビデオでは、以前のビデオに登場した野生型線虫を用い、ALD carbに3時間曝露させた時点での様子を確認します。このALD carbアッセイの最終時点において、これらの線虫は野生型であるにもかかわらず、完全に不動であるか、あるいはかろうじて動いている状態であることが明確に見て取れます。これらの線虫は、ALD carb曝露1時間後に示したTOM-1およびM25変異体と表現型が類似しており、これはおそらく興奮性コリン作動性伝達が同レベルに達したためと考えられます。対照的に、Synap Bren-1変異体はALD carbに3時間曝露した後でも、かなりの可動性を維持しています。この結果は、正常なレベルの神経伝達物質放出を欠くSynaptive Bren one変異体が、同レベルのalde carb曝露後において、野生型虫よりもボディウォール筋肉でのコリン作動性刺激が少ないことと一致しています。コリン作動性伝達に特異的な欠損を持つPoint on four変異体は、Synaptive Bren one変異体と同様のAl Decarbに対する感受性を示すはずです。逆に、Tomasin oneおよびO 25過剰感受性変異体は、野生型虫と同様に麻痺したままとなります。一部の線虫、特にAl Decarbに耐性を持つ個体は、プレートの外へ這い出そうとする場合があることに注意してください。このような場合、線虫の移動を妨げる物理的障壁として、一定量のパルミチン酸を塗布することができます。Al Decarbプレートの周囲に、10 mg/mLのパルミチン酸/エタノール溶液を25 µL塗布しました。これでAl Decarb曝露パラダイムは終了です。次に、Penta Lean Terazol曝露パラダイムを実演します。PTZアッセイについては、Kaylin Berryがサポートします。PTZアッセイのための線虫の準備は、基本的にアルデヒドカルボニルアッセイ（alde carb assays）のための準備と同様です。これら2つのアッセイの主な違いは以下の点のみです。PTZの溶媒として70% ethanolの代わりにDDH two Oを使用します。また、PTZはALDE carbよりも大量に播種することが多いため、OP 50を添加する前にプレートを少なくとも1時間乾燥させます。PTZにはパルミチン酸を使用することも可能です。また、PTZはalde carbよりもはるかに不安定であり、-20°Cで保存する必要があることに注意してください。解析を開始するために、1時間にわたり30分ごとに、てんかん様の光誘発性痙攣を起こしているワームの数をカウントします。痙攣のタイプ別に、全身痙攣、前方痙攣（ヘッドボブと呼ぶ）、前方痙攣と体壁筋麻痺の組み合わせ（強直間代と呼ぶ）、または全身麻痺（強直と呼ぶ）などの個別のカテゴリーに分けてスコアを付けるのが最適です。右側のワームに見られるような発作様活動は、多くの場合、左側のワームに見られるような強直間代痙攣の後に起こります。発作のような活動は、単に反復的な強直間代性痙攣に続く筋肉疲労の結果である可能性があります。しかし、我々の未発表データでは、一部の虫が、以前に強直間代性痙攣を起こしていない状態で、al decarb誘導麻痺と同様の方法でPTZにより強直状態になることが示されています。ここでは、代表的なシナプス伝達変異虫が、各種の発作およびてんかん動物モデルにおける一般的な発作誘発剤でありGABA受容体アンタゴニストであるPTZが存在しない状態で這っている様子を示します。虫が採餌している間、先端または鼻の部分が左右に振れていることに注目してください。このビデオでは、前のビデオで使用したものと同じシナプス伝達変異株の別の虫を示します。2.5 mg/mLのPTZを含む水の中にいるこの虫は、採餌中にほとんどの場合、頭を左右に動かし続けていることがわかります。しかし、この線虫は時折、左右への探索行動を停止し、代わりに前方を繰り返し突き出す動作を見せます。最後に、前の2つのビデオと同じ変異を持つ線虫を、10 mg/mLのPTZを含む水に曝露させた様子を確認します。この線虫は、左右への探索行動が減少しており、PTZの濃度が低い時よりも高い頻度と強度で前方を突き出していることに注目してください。これらの結果は、PTZの用量依存性を示すものであり、これはすべてのPTZ感受性シナプス伝達変異体において観察されます。重要な点として、野生型虫へのPTZ曝露だけでは、てんかん様痙攣を誘発するには不十分です。同様に、cholinergic伝達に特異的な欠損を持つ虫（fourなど）や、cholinergic伝達が過剰な虫（tomasin oneなど）においても、PTZ誘発性のてんかん様痙攣を試みましたが、観察されませんでした。したがって、PTZに対する相対的な感受性に基づいて、アルデヒドカルボン酸耐性を有するシナプス伝達変異体を、一般的なシナプス機能の欠損によるものか、あるいはコリン作動性伝達の特異的な欠損によるものかで、さらに特性評価することが可能であると考えられます。意外かもしれませんが、C. elegansの抑制性運動ニューロンにおいて検出可能なGABA発現を欠く、機能が著しく低下したONC 25変異体では、このビデオに見られるような自発的なてんかん様痙攣は認められません。10 mg/mLのPTZ（水溶液）を投与したONC 25変異体において、頑健な強直間代痙攣が認められました。ただし、図示されていないものの、ONC 25に関連する強直間代痙攣に先立って、わずかな動きを伴う前部のみの痙攣が発生し、これはsynap Bren 1変異体の痙攣に類似していました。したがって、実験者は、特にハイポモルフィック（機能低下）な変異対立遺伝子が得られる可能性を考慮し、すべての抑制性GABA変異体がPTZ存在下で強直間代痙攣またはそれに密接に関連する強直性てんかん様活動を示すと想定すべきではありません。抑制性GABA変異体ではalde carbおよびPTZに対して過敏性を示し、一方でコリン作動性伝達の負の調節を欠く変異体ではalde carbに対してのみ過敏性を示しPTZに対しては通常の感受性を示すことが実証されました。そこで、他のシナプス伝達変異体と同様にalde carbに対して過敏であるUNC 43機能喪失変異体が、PTZに対してどのような反応を示すかという疑問が生じます。UNC 43変異体は、PTZがない状態では明らかなてんかん様の痙攣を示しません。ただし、これらの変異体では稀に非反復性ではあるものの自発的な全身収縮が見られます。しかし、10 mg/mLのPTZ水溶液に曝露させると、UNC 43機能喪失変異体は、強固で反復的な、用量依存的な全身痙攣を呈します。現時点では、これらの結果は曖昧ですが、UNC 43が抑制性GABA作動性伝達において特定の役割を持っていないか、あるいは神経伝達物質放出の負の調節においてのみ役割を担っていることを示唆していると考えられます。C. elegansの神経系において、相補的な神経刺激剤であるコリンエステラーゼ阻害剤のAldicarbおよびGABA受容体拮抗薬のPTZを用いて、CL elganシナプス伝達変異体を特性評価する方法を説明しました。相補的な薬理学的パラダイムに従う際は、一方の神経刺激剤に対する感受性の程度から、もう一方の神経刺激剤に対する感受性の程度を予測することはできないという点に留意してください。Aldicarbアッセイを利用することで、PTZでヘッドボビング（head bob）を示すがAldicarbに超感受性である抑制性GABA変異体と、同じくPTZでヘッドボビングを示すがAldicarbに耐性を持つ全般的なシナプス機能不全変異体を区別できるはずです。さらに、抑制性GABA変異体はPTZでヘッドボビングを示す一方で、コリン作動性伝達の負の制御を欠く虫は、PTZにおいて野生型と同様に見えることを理解しておく必要があります。したがって、PTZアッセイを用いることで、どちらもAlde carbに対して高感度であるこれら複数のクラスのシナプス伝達変異体を区別することが可能です。要約すると、PTZおよびAlde carbアッセイによる相補的なアプローチを用いることで、いずれか一方の薬剤のみでは不可能な方法でC. elegansのシナプス伝達変異体を特性解析できると考えられます。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。

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