C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

こんにちは、アラバマ大学生物科学部コールドウェル研究所のCody Lockeです。私はカイル・リーで、アウトタ炭水化物とPTZ曝露アッセイのためのワームの調製方法をお見せします。私はバーナード・トゥで、炭水化物アッセイの実施方法を実演します。

私はケイリン・ベリーで、海のエレガンスのビデオを担当しています。このプレゼンテーションでは、このプレゼンテーションのナレーションとPTZ曝露アッセイのデモンストレーションを行います。今日、私の同僚と私は、一連の代表的な変異株を持つPTZおよびAlde炭水化物への曝露後のてんかんのシーエレガンスモデルを使用して、シナプス伝達変異体を特徴付ける方法を示します。

それでは始めましょう。今日は、Kyle Leeが手術初日にALD炭水化物アッセイの準備をご案内します。各遺伝子型および各複製の少なくとも30匹の若年成人期の線虫が、2日目にALD炭水化物アッセイに利用できることを確認してください。

実験者が50種類以上のL型4段線虫を、大腸菌OP 50を食料源として装着した新鮮な殺菌剤を含まないNGMプレートに選択するのが最善です。ワームを一定で許容できる温度で12〜24時間成長させます。摂氏20度から摂氏22度が最適ですが、摂氏25度でもかまいません。

2日目には、Al Decarbと70%エタノールの100ミリモルのストック溶液を作り、適切な量のAl DecarbをNGMプレートに広げます。37.5マイクロリットルの100ミリモルアルデ炭水化物を60ミリメートルのノンベントペトリプレートに7.5ミリリットルのgmでメッキすることにより、0.5ミリモルアルデカーブを一貫して使用しています。アルデ炭水化物プレートを室温で約30〜60分間乾燥させます。

プレートが乾いた後、蓋を割る必要はありません。各アルデ炭水化物プレートの中央に一定量の大腸菌を加え、さらに30〜60分間乾燥させます。室温では、通常、25マイクロリットルの大腸菌OP50を追加します。

このボリュームのOP 50は、ミミズをプレートの中央の小さなスポットに過密にすることなく維持するのに十分なサイズの食品芝生を作成します。食用芝生が乾いたら、アルバ炭水化物アッセイに進みます。ALD炭水化物アッセイは主観的な性質を持つため、実験は盲目的に行うことを強くお勧めします。

これを行うには。主要な実験者の同僚が、分析するワームを含む元のプレートにラベルを変更するか、同僚がタイマーを開始する直前に元のプレートから暗号アルデ炭水化物プレートにワームを移すことができます。プレートが装着されたので、ホウ素ABOは分析を開始し、麻痺した線虫の数を数えるために分析を進めます。

急性アルデカルブ誘発性麻痺を定義するには、主に2つのアプローチがあります。最初のアプローチは、咽頭ポンプの停止による麻痺を定義します。このビデオノートでは、画面右側の線虫咽頭の内腔内にある暗い構造を示しています。

この構造はグラインダーと呼ばれ、コリン作動性メカニズムを通じてリズミカルに収縮します。このビデオの線虫の移動は、アル・デカーブの曝露により大幅に遅くなっています。それでも、このワームの咽頭グラインダーはまだはっきりと動いています。

したがって、このワームは、ポンピング定義の停止によって麻痺することはありません。このビデオでは、画面の右側にある咽頭グラインダーが、アルデカーブ誘発性麻痺の作業定義であるポンピングの停止によって収縮していないことがわかります。このワームは麻痺していると評価されるべきです。

ただし、前のビデオのワームと同様に、このワームはわずかな左右の採餌動作を示しています。アル・デカルブによってその運動が損なわれているにもかかわらず、これらの動きは、実験者がアル・デカルブが引き起こす麻痺、全身の不動、および触覚に対する無反応を定義するための2番目のアプローチによって、この線虫が麻痺していると見なすのを防ぐでしょう。アルデカルブ誘発性麻痺を定義するための2番目のアプローチは、プラチナワイヤーで各線虫を一貫して突いて反応を確認することです。

肉眼で体の動きを検出できない場合、私たちの好ましいアプローチは、30分ごとにワームを頭に2回、尾に2回、合計3時間突くことです。ご覧のとおり、このビデオのワームは明らかに体を動かしていません。それにもかかわらず、このワームは尾をはっきりと動かすことで突っ込みに反応するため、このワームを麻痺とは呼びません。

アルデカルブ誘発性麻痺の2番目の定義による。前のビデオのワームと同様に、このワームは明らかに体を動かしていないため、突っ込みテストが必要です。しかし、前のビデオのワームとは異なり、このワームは突き刺しに対して明確に反応しません。

したがって、このワームは、アルデカルブ誘発性麻痺の2番目の定義によって麻痺します。アルデカルボによって麻痺した人と麻痺していない人の違いは微妙な場合がありますが、実験者は、アルデカルブプレートに摘み取られた直後にアルデカルブに曝露された多数の代表的なワームを観察するだけで、大幅な変化とシナプス伝達を特定できるはずです。野生型のワームはまだ動きやすいです。

このビデオでは。前のビデオと同じ野生型のワームが、Al Decarbに1時間さらされると表示されます。ワームはある程度遅くなっていますが、まだ明らかに動いていることに注意してください。

野生型の線虫とは異なり、このビデオのトマシン1の突然変異体は、1時間の曝露後に完全に動けなくなるか、ほとんど動いていません。この結果は、神経筋接合部での神経伝達物質の放出を負に調節できないことから過剰なアセチルコリン分泌を有するトマシン1変異体と一致しており、過剰なアセチルコリンおよび神経筋接合部でのシナプス間隙はアセチルコリン分解の阻害と組み合わされ、ビアルデカーブはトマシン1変異体を過敏にしますが、ここには示されていませんが、同様の結果は、43の機能喪失対立遺伝子を伴うアルデ炭水化物アッセイから生じると仮定されています。 これは、カルシウムカルムーラン依存性プロテインキナーゼ2のCエレガンスオルトログをコードしています。このビデオは、抑制性GABA作動性伝達が欠損している25の変異体を示しています。

トマシン1およびM 43変異体と同様に、アルデ炭水化物に1時間曝露した後、これらの変異体は有意なアルデ炭水化物誘発性自発運動E障害を示し、同じ時間アルデカーブに曝露した野生型ワームよりも影響を受けるようです。この結果は、アルデカルブ曝露とGABA作動性伝達の減少の組み合わせにより体壁の筋肉が過剰に刺激され、CL ELの神経筋接合部における興奮性から抑制性伝達への比率が高くなり、その後の麻痺が進行するM 25変異体と一致しています。しかし、トマシン1の43および25変異体は、この時点でアル・デカーブと同様の感受性を示すためである。

体壁の筋肉の過剰刺激にはさまざまな原因があるにもかかわらず、実験者はまず原因となる突然変異の正体を知らなければ、過敏症の根本的なメカニズムを知ることができませんでした。このビデオでは、ALD炭水化物アッセイのこの終点でアルデカルブを3時間曝露した後、前のビデオと同じ野生型のワームに戻りましたが、これらのワームは野生型であるにもかかわらず、完全に動けないか、ほとんど動いていないことがはっきりとわかります。これらの線虫は、現在、アルデ炭水化物曝露の1時間後に示されたTOM oneおよびM 25変異体と表現型的に類似しており、おそらく興奮性コリン作動性感染が野生型線虫とは対照的に同等のレベルに達しているため、Synap Bren one変異体はアルデ炭水化物への3時間の曝露でかなり可動性を維持します。

この結果は、神経伝達物質の分泌が正常なレベルを欠いており、この時点で同じレベルのアルデ炭水化物曝露を受けたウッド野生型ワームよりも体壁の筋肉でのコリン作動性刺激が少ないSynaptive Bren one変異体と一致しています。コリン作動性伝達が特に欠損している4つの変異体上のポイントは、Synaptive Bren one変異体と同様にAl Decarbと同様の感度を持つはずです。逆に、トマシン1とO 25の過敏変異体は、野生型の線虫とは異なり、麻痺したままです。

一部のワーム、特にAl Decarbに耐性のあるワームは、プレートから這い出そうとする可能性があることは注目に値します。この場合、実験者は、ワームの移動に対する物理的な障壁であるパルミチン酸を一定量拡散する可能性があります。Al Decarbプレートの周りには、エタノール1ミリリットルあたり10ミリグラムのパルミチン酸を25マイクロリットル広げます。

これで、Al Decarbエクスポージャーパラダイムは完了です。次に、Penta Lean Terazolの曝露パラダイムを示します。Kaylin BerryがPTZアッセイをお手伝いします。

PTZアッセイ用のワームの調製は、アルデ炭水化物アッセイ用のワームの調製と基本的に同じです。2つのアッセイの唯一の有意な違いは、以下のとおりです。PTZ溶媒として、70%エタノールの代わりにDDH two Oを使用します。

また、ALDEキャブレターよりも大量のPTZをプレート化することが多いため、プレートを少なくとも1時間乾燥させてからOP50を追加します。パルミチン酸はPTZと一緒に使用することもできます。また、PTZはアルデキャブレターよりもはるかに安定性が低く、摂氏マイナス20度で保管する必要があることに注意することが重要です。

分析を開始するには、てんかん性光痙攣虫の数を30分ごとに合計1時間カウントします。全身痙攣、前部痙攣、頭ボブと呼ばれる前部痙攣と体壁筋麻痺の組み合わせなど、さまざまなタイプの痙攣を持つワームの数を別々のカテゴリでスコアリングするのが最善です。右側のワームに見られる発作様の活動は、左側のトニックにワームに見られるように、強直間代性けいれんに続くことがよくあります。

発作のような活動は、単に繰り返しの強直間代性痙攣後の筋肉疲労から生じる可能性があります。しかし、私たちの未発表のデータは、一部の線虫が以前に強直間代性であったことがなくても、アルデカルブ誘発性麻痺と同様の方法でPTZで強直性になる可能性があることを示しています。ここでは、発作とてんかんのさまざまな動物モデルにおいて、PTZA GABA受容体拮抗薬と一般的な発作誘導剤の非存在下で這う代表的なシナプス伝達変異虫を示します。

ワームの先端または鼻が採餌中に左右に揺れていることに注意してください。このビデオでは、前のビデオで使用したのと同じシナプス伝達変異株の別の線虫を示しています。このワームは、水1ミリリットルあたり2.5ミリグラムのPTZの存在下にあり、ほとんどの場合、採餌中に頭を左右に動かし続けていることに注意してください。

しかし、このワームは時折、左右に採餌を停止し、代わりに前方に繰り返し突き出します。最後に、前の2つのビデオのワームと同じ突然変異を持つワームが、水1ミリリットルあたり10ミリグラムのPTZの存在下で見られるはずです。このワームは左右の採餌が減少しており、PTZの濃度が低い場合よりも高い頻度と強度で前方に突き出ていることに注意してください。

これらの結果は、PTZの用量依存性を示しており、これはすべてのPTZ感受性シナプス伝達変異体で観察されます。重要なことに、PTZへの曝露は、野生型線虫のてんかん様痙攣を誘発するのに十分ではありません。同様に、PTZ誘発性てんかんのような痙攣は、4つのコリン作動性伝達に特定の欠損がある線虫や、トマシン1などの過剰なコリン作動性伝染を伴う線虫で試みられましたが、観察されていません。

したがって、PTZに対する相対的な感受性に基づいて、一般的なシナプス機能の欠損またはコリン作動性伝達の特定の欠損のいずれかから、アルデ炭水化物抵抗性を持つシナプス伝達変異体をさらに特徴付けることが可能であるはずです。おそらく驚くべきことに、機能ONC 25変異体の大幅な低下は、C eleganceで検出可能なGABA発現を欠いています。抑制性運動ニューロンは、このビデオで見られるように、自発的なてんかん性光痙攣を示さない。

水1ミリリットルあたり10ミリグラムのPTZに対するONC 25変異体。しかし、強直間代性痙攣を示しますが、ONC 25に関連する強直間代性痙攣に先行し、シナップブレン1変異体の痙攣を模倣したいくつかの動きを伴う前方のみの痙攣は示されていません。したがって、実験者は、特に低型変異体対立遺伝子を得る可能性を考慮して、すべての抑制性GABA変異体がPTZの存在下で強直間代性痙攣または密接に関連する強直性発作様活性を示すと想定すべきではない。

現在、抑制性GABA変異体によるアルデ炭水化物とPTZに対する過敏症が示されていますが、アルデ炭水化物に対する過敏症と、コリン作動性伝達の負の制御を欠く変異体によるPTZに対する正常な感受性のみを示しています。1つは、UNC 43の機能喪失の突然変異体は、PTZでどのように見えるか疑問に思うかもしれません。彼らはまた、アルダ炭水化物に過敏であるため、43の突然変異体は、PTZの不在下で痙攣のような明らかなてんかんを示さないが、これらの突然変異体は、まれな非反復性ですが、まだ自発的な全身収縮は、43の水のミリリットルあたり10ミリグラムのPTZにさらされた後です。 機能喪失変異体が存在し、堅牢で反復性で、用量依存的な全身痙攣。現時点では、これらの結果は曖昧ですが、43は抑制性GABA作動性伝達に特定の役割を果たしてはならない、または神経伝達物質放出の負の調節のみに役割を果たしてはならないことを示しているようです。

Cエレガンス神経系では、補完的な神経刺激剤、アルデ炭水化物、コリンエステラーゼ阻害剤、およびPTZA GABA受容体拮抗薬を使用して、CLエルガンシナプス伝達変異体を特徴付ける方法を示しました。どちらか補完的な薬理学的パラダイムに従うときは、1つの神経刺激剤に対する感度の程度は、他の神経刺激剤に対する感度の程度を予測することができないことを覚えておいてくださいアルデ炭水化物アッセイの利用は、PTZのボブを頭に浮かべるが、一般的なシナプス機能欠損変異体からアルデ炭水化物に過敏である抑制性GABA変異体を区別するのに役立つはずです。 これもPTZでボブを頭に浮かべますが、アルデ炭水化物に耐性があります。さらに、抑制性GABA変異体はPTZでボブを頭に浮かべ、コリン作動性伝達の負の調節を欠く線虫はPTZで野生型に見えることを認識する必要があります。

したがって、PTZアッセイは、アルデ炭水化物に対して過敏なシナプス伝達変異体のこれらのクラスを区別するためにも使用できます。要約すると、PTZおよびAlde炭水化物アッセイを用いた補完的なアプローチにより、実験者は、どちらの薬剤でも単独では不可能な方法でCエレガントなシナプス伝達変異体を特徴づけることができるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。