セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

こんにちは、MIT生物学部のスーザン・ライナス研究室の大学院生、ランドール・ホフマンです。今日は、半変性洗剤アグロローズ、ゲル電気泳動、またはSDDエイジについてご紹介します。当研究室では、この技術を用いてプリオンなどのアロゲンタンパク質をスクリーニングしています。

当社のバージョンのSDD年代はシンプルで信頼性が高く、任意の数のサンプルに対応するようにスケーリングできます。アミロイドはSDSによる変性に対して非常に耐性があり、SDDHを使用して他のタンパク質から分離することができます。しかし、SDDHのデータだけでは、何かがアミロイドであることを確認することはできません。

そのためには、他の手法を使用する必要があります。それを念頭に置いて、お見せしましょう。S-D-D-H-S-D-D-Hは、水平DNA電気泳動用の標準的な装置を使用して実行できます。

まず、ゲルキャスティングトレイを組み立てる必要があります。装置のサイズは、サンプルの数によって異なります。サンプルの数が多い場合は、20 x 24 cmのスラブと、最大4つの50ウェルコームを使用します。

ゲルを調製するには、中または高のゲル強度低、EEO agros、XTAEバッファー1個、およびSDSの10%ストック溶液が必要です。ゲルをできるだけ厚くして、より多くのサンプルをロードし、検出を最大にできるようにする必要があります。混合物を電子レンジで加熱し、アロスが完全に溶解するまで加熱します。

100 XSDSストックを0.1%にすばやく加え、渦巻いて混合します。このステップでアグロが固化した場合は、赤く、ホットプレートに溶かします。沸騰させないように注意してください。

溶液が泡立ちやすいため、SDSを追加した後、まだ熱いうちにこの溶液をキャスティングトレイに注ぎます。次に、コームを使用して、後でゲルの転写中に干渉する可能性のある気泡を取り除きます。ゲルが完全に冷却されて固まったら、コームを慎重に取り外し、ゲルをタンクに入れます。

ゲルを0.1%SDSを含む1つのXTAEに完全に浸します。これで、サンプルをロードする準備が整いました。SDDHで使用されるタンパク質サンプルは、SDSページと同様に調製されますが、2つの重要な例外があります。

まず、凝集体をタンパク質モノマーに変性させる可能性のあるサンプルの加熱を避ける必要があります。次に、タンパク質の分解を避けるように注意してください。ここで使用した変性条件は、すべてのプロテアーゼを不活性化するには十分ではないため、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルの推奨濃度の少なくとも2倍を使用することをお勧めします。

このデモンストレーションでは、目的の特定のタンパク質を過剰に発現している酵母細胞のライセートを使用します。私たちは通常、一晩で2ミルを使用します。96で培養した培養物は、VWRから入手できるウェルブロックですが、存在量の少ないタンパク質を分析する場合は、より多くの培養物を使用する必要があります。

遠心分離後、室温で2000 RCFで培養物を5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を除去し、Resusで水に懸濁し、2回目のスピン後に再度遠心分離して細胞を洗浄し、上清を除去し、予備のめっき液で細胞を樹脂化します。溶液中のzyは細胞壁を消化するため、細胞を効率的に溶解し、少量の溶解バッファーを溶解することができます。摂氏30度で30分間インキュベートします。

予備のプラスチックセルに、今度は800 RCFで5分間ペレットを送ります。セートを完全に除去し、各ペレットと100マイクロリットルの溶解バッファーを再懸濁します。次に、ブロックをテープで覆い、高速で2分間渦巻きます。

これは、すべての球体プラスチックが4, 000 RCFで細胞の破片をLY Pアウトするのに役立ちます。2分間。Sナチンを96ウェルPCRプレートに慎重に移します。

通常、私たちの研究室では一度に数百のサンプルを分析するため、これを支援するのがリキッドハンドリングシステムです。必要に応じて、ライセートのタンパク質濃度を決定します。次に、4つのxサンプルバッファーをサンプルに加えて、1つのxサンプルバッファーを含むライセートを生成し、室温で5分間インキュベートします。

次に、サンプルをゲルにロードします。必要に応じて、サンプルの半分を SDS ページ分析用に保存します。また、既染色マーカーを含む分子量マーカーや、チキンフレクターs抽出物などの非常に高分子量マーカーをロードします。

必要に応じて、低分子量タンパク質の拡散を防ぐためにゲルを冷やしておくことが重要であるため、冷蔵室で泳がせるとよいでしょう。ゲルの長さの3ボルト/センチメートル未満の低電圧でゲルを泳動します。ディアレがゲルの端から約1cmに達するまで、ゲルを数時間実行します。

アミロイドは室温で2%SDSによって変性されないため、アミロイドは無傷のままですが、ほとんどの非アミロイド凝集体を含む他の複合体は2%SDSの存在下で解離します。したがって、ほとんどのタンパク質は単量体であり、ゲル内を素早く通過します。一方、SDS耐性の高分子量アミロイドは、よりゆっくりと移動します。

この後、ゲルは転写の準備が整います。複数の転写方法を使用できますが、キャピラリー転写を使用して最良の結果が得られます。キャピラリートランスファーはあらゆるサイズのゲルに対応できるため、キャピラリートランスファーで数百のサンプルを分析することが実用的です。

ドライブロッティングペーパーのスタックは、ゲルを介して緩衝液を引き込み、紙とゲルの間に配置されたニトロセルロースメンブレンにタンパク質を沈着させる役割を果たします。高結合Cなどのニトロセルロースをゲルと同じ寸法にカットする必要があります。また、20枚のGBO oh 4枚と8枚のGBO oh 2吸い取り紙をゲルと同じサイズにカットする必要があります。

GB oh fourは非常に厚く、吸収性があります。GBO oh 2ははるかに薄く、より細かい質感を持っているため、膜との接触がより均一になります。芯として使用するGBO oh fourの追加部分をカットし、浸したゲルよりも約20センチ幅にします。

亜硝酸UL WICとプラスチック容器に入ったGBO oh 2と1 XTBSの4つのピースは、次のように紙のスタックを組み立て、20ピースの乾燥GBO oh fourを組み立てます。次に、ドライGBOの4個、ああ、2個。次に、事前に濡れたGBOの1枚、ああ、2つ。

このスタックの上にニトロセルロースを置きます。キャスティングトレイのゲルを水で短時間すすぎ、余分なランニングバッファーを取り除きます。次に、必要に応じてTBSでメンブレンをトレイからスライドさせながら、ゲルをトレイからスタックに慎重にスライドさせ始めます。

追加のバッファーは、気泡がゲルに閉じ込められるのを防ぐのに役立ちます。トランスファーピペットは、ゲルがスタックに完全に移動された後、この目的に適しています。気泡がある場合は、十分にチェックしてください。

ゲルの端を持ち上げ、気泡がうまくいくまでバッファーを再塗布します。残りの3つの事前に濡れたGBO、ああ、2個をゲルの上に置きます。ピペットをスタックの上部にしっかりと転がすことにより、すべての層が完全に接触するようにします。

TBSが入った2つの昇降トレイでトランスファースタックの側面に、事前に濡れた芯をスタック全体に垂らし、芯の両端が水没するようにします。TBSでは、組み立てられたトランスファースタックを、500ミルのボトル入り飲料水などの追加の重量を支える追加のプラスチックトレイで覆います。芯はトレイからバッファーを引き出し、ドライブロッティングペーパーは数時間かけてバッファーをゲルを通して引き出します。

これにより、タンパク質がメンブレンに沈着し、転写が最低3時間または一晩進行するようになります。キャピラリートランスファーが完了した後、メンブレンは標準的なウェスタンブロッティングで処理できます。ここでは、特定のタンパク質がアミロイドを形成する素因となる酵母株で過剰発現したタンパク質の典型的なブロットを示しています。

私たちの候補のいくつかは、ここやここに示されているようなアミロイドまたは高分子量のSDS耐性種を非常によく形成していることをはっきりと見ることができます。しかし、他のものは凝集体を形成せず、これらやこれらのように完全に単量体です。さらに、アミロイドポリマーのサイズはタンパク質によって異なることがわかり、これはこれら2つのレーンで見ることができます。

、候補プリオンのアミロイドなど、高分子量の不溶性凝集体を分析する簡単な方法をお見せしました。私たちのプレゼンテーションをご覧いただき、この技術がお役に立ち、エイミー免疫原性タンパク質の研究にお役立たれていただければ幸いです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの研究に頑張ってください。