Name: セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶセミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動（SDD-AGE）によるアミロイド凝集のスクリーニング法。酵母細胞を用いた大規模サンプル分析に適応可能で、神経変性疾患研究に有用な技術です。

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我々は、このプロトコルの開発と援助のためにサイモンアルベルティに感謝。この作品は、国立衛生研究所（GM25874）、ハワードヒューズ医学研究所のInvestigatorship（SLまで）、および国立科学財団博士号を取得する前の訓練助成金（RHまで）からの助成金によって支えられて。

<html>パート1：ゲルの準備<ol><li>ゲルキャスティングトレイを組み立てます。水平方向のDNAの電気泳動のための標準機器を使用することができます。大量のサンプルでは、​​最大4つの50ウェルコームを持つx 24センチメートルスラブ20cmの準備。これらは、ブロットの画像を歪ませることができるようにスラブが、傷を持っていないことを確認してください。 </li><li> 1X TAEの1.5％アガロース溶液（培地または高ゲル強度、低いEEO）を作成します。ボリュームは完全に水没するのに十分な櫛歯でなければなりません - あなたは、検出を最大化するために、できるだけ多くのサンプルを読み込むことになるでしょう。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで混合。 </li><li>急速に10％の株式を0.1％にSDSを追加。ミックスに渦巻く。いくつかのアガロースがこのステップ中に固化する場合、ホットプレートを用いて再溶解し、沸騰を避けるために注意してください。 </li><li>キャスティングトレイにソリューションを注ぐ。彼らは後に転送を妨げる可能性があるので、あらゆる気泡アウト熊手に櫛を使用してください。 </li><li>ゲルが設定された後、櫛を削除し、ゲルのタンクにゲルを置く。完全に水没1X TAEのゲルは、0.1％SDSを含む。 </li></ol>第2部：準備のサンプル<ol><li>酵母溶解物のハイスループット分析のために、我々は、96ウェルブロック単位で急速に撹拌しながら一晩生育2 mlの培養液から始まります。この場合、それぞれの文化が過剰発現は、目的のタンパク質です。低濃度のタンパク質を分析する際に、大きな文化のボリュームを使用する必要があります</li><li>室温で5分間2000 RCFで遠心分離により細胞を回収。 </li><li>再び水と遠心で細胞を再懸濁します。 </li><li> 1ミリリットルspheroplasting溶液中に再懸濁します。 30 ° C（あなたが顕微鏡によりspheroplasting効率を確認すること）で約30分間インキュベートする。 </li><li>室温で5分間、800 RCFで遠心する。完全に上清を取り除く。 </li><li> 100 mlの溶解バッファーでペレットスフェロプラストを再懸濁します。 </li><li>テープと2分間高速でボルテックスでブロックをカバー。 </li><li> 2分は4000 RCFでペレットを細胞破片。 </li><li>慎重に新しい容器、例えば、96ウェルPCRプレートに上清を取り除く。 </li><li>必要に応じて、溶解液のタンパク質濃度を決定する。 </li><li> 1Xサンプルバッファーを含む溶解液を生成するためにサンプルに4Xサンプルバッファーを添加します。室温で5分間インキュベートする。 </li><li>ゲルをロードします。必要に応じて、サンプルの量の半分を保存し、SDS - PAGE分析のためにそれを煮る。後で転送の程度を監視するために、事前に染色したSDS - PAGEのマーカーが含まれています。さらに、非常に大規模なタンパク質（例えば、ニワトリ胸筋エキス）から成る分子量マーカーを解決複合体の大きさを推定するために使用することができます。 </li><li>色素フロントがゲルの端から約1センチメートルに達するまで、低電圧（≤3 V / cmのゲルの長さ）で動作します。これには数時間かかります。ゲルは涼しいままであることが重要です、それ以外の低分子量のタンパク質（例えば、単量体）の拡散は、それらの検出を制限することができます。 </li></ol>パート3：転送<ol><li>ゲルと同じ大きさにニトロセルロースの部分をカット。 </li><li>ゲルと同じ大きさにGB002吸い取り紙のGB004と8個、20個をカット。芯として使用されるGB004の追加部分をカットし、ゲルよりも約20cm広いそれを作る。 </li><li>ニトロセルロース、芯、および1X TBSでGB002の4個を浸し。 </li><li>ドライGB004の20個、その後乾いたGB002の4枚、その後プリウェットGB002の一枚：プラスチック容器では、次のように紙のスタックを組み立てる。ニトロセルロースは、このスタックの一番上に置く。 </li><li>過剰な実行中のバッファを削除するには、水で簡単にキャスティングトレイ上でゲルをすすぐ。その後、慎重にスタックにプッシュトレイからゲルをスライドし始める。トレイからゲルをスライドさせながら、必要に応じてTBSで膜を消す。余分なバッファは、ゲルの下敷きになってから泡を防ぐのに役立ちます。転送ピペットは、この目的に適しています。 </li><li>ゲルがスタックに移動された後、泡が十分に確認してください。いずれかが存在する場合、ゲルの端を持ち上げ、気泡が正常に機能できるようになるまでバッファを再適用します。 </li><li>ゲルの上に残りの3つのプレ接液GB002ピースを置く。スタックの上部にしっかりとピペットを圧延して、すべてのレイヤーの間に徹底的な連絡を確保する。 </li><li> TBSを含む二つの高架トレイと脇腹転送スタックを。芯のどちらかの端がTBSに水没するようなスタック全体でプリウェット芯を羽織る。 </li><li>余分な重量を（例えば、水の500mlボトル）を有する追加のプラスチック製のトレイでアセンブル転送スタックをカバーする。 </li><li>転送は3時間の最小値、または一晩のために続行することができます。 </li><li>転送後、メンブレンは標準ウェスタンブロット法で処理することができます。 </li></ol> Spheroplastingソリューション 1.2 M D -ソルビトール 0.5mMのMgCl 2の 20mMトリス、pH7.5の 50mMのBME（新鮮な追加） は0.5 mg / mlのザイモリアーゼ100T（新鮮な追加） coration：下線;&quot;&gt;溶解バッファー 100mMのトリス7.5 50mMのNaCl 10mMのBME（新鮮な追加） プロテアーゼ阻害剤（新鮮な追加） 4Xサンプルバッファー 2X TAE 20％のグリセロール 8％SDS 好みにブロモフェノールブルー

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD - AGEは、最初Kryndushkinらによって報告された。1のSDS耐性の複合体を研究するために[PSI +]酵母におけるプリオン、と以来、プリオンと非プリオン凝集体2から9の両方を研究する広範な使用を発見した。しかし、アガロースゲルの膜以下の電気泳動のタンパク質の転送には問題がある、と歪んだブロットの画像5で発生する可能性があります。また、最も一般的に使用される水中エレクトロブロッティングの手法は、このようにゲルの大きさと処理できるサンプル数のための実際的な制限が導入されています。我々は、下向きにキャピラリートランスファー10、ゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を転送するためにドライブロッティング紙のスタックを使用する単純な手順を採用することにより、これらの問題に対処している。キャピラリートランスファーには、歪みを防止し、大きなゲルを容易に処理することが可能になります。 SDD - AGEを使用する前に、次の事項を考慮する必要があります。原油サンプル（例えば、溶解液）の場合は、特定のタンパク質の免疫検出が必要です。 SDD - AGEは完全に興味の蛋白質複合体を変性させないので、検出される蛋白質（s）はアミロイド地域の外にエピトープタグを負担しなければならない。彼らは通常のSDS - PAGEのためになるように溶解液は、一般的に2つの重要な違いで、調製することができる。最初に、タンパク質分解による劣化を防止するために増加に注意する必要があります。ここで使用される部分的に変性条件下では、プロテアーゼを不活性化するには不十分であり、また、タンパク質分解の標的蛋白質が影響を受けやすくすることができます。少なくとも2倍の推奨濃度で完全なプロテアーゼ阻害剤のカクテルを使用してください。第二に、サンプルを加熱することは避けるべきです。全単量体陰性コントロールが必要な場合には、例えば高分子量の種が単量体蛋白質に最もアミロイドを復元する共有結合修飾、95℃で10分間インキュベート° Cを使用することができる、によるものではないことを確認する。

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>誠化学生工業株式会社</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Halt プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-C extra ニトロセルロース</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>GB004 ブロッティングペーパー</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>GB002 (3MM Chr) ブロッティングペーパー</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>アガロース (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

アミロイド凝集は、下等生物に有益な役割を持っていると考えられているコンホメーション、自己鋳型タンパク質である多数のタンパク質のミスフォールディングの病態と根底プリオンの感染特性、関連付けられています。アミロイドは、不溶性と構造の異質性のために勉強するのが困難でした。しかし、大きさと界面活性剤不溶性に基づくアミロイド重合体の分解能は、洗剤、アガロースゲル電気泳動（SDD - AGE）セミ変性によって可能とされています。この手法は、アミロイドコンフォメーションの変種の検出と特性評価のための広範な使用を見つけることです。ここで、我々はそのような新規のプリオンおよび他のアミロイド蛋白質のためのスクリーンのような大規模なアプリケーションでその使用を容易にこの技術の適応を示しています。新しいSDD - AGEの方法は、より高い信頼性と使いやすさのためにキャピラリートランスファーを使用して、任意のサイズのゲルを収容することができます。従って、細胞または精製タンパク質から調製したサンプルの多くは、タグ融合タンパク質のSDS不溶性配座の存在を同時に処理することができます。

SDD - AGEは細胞内のポリマーのようなアミロイドの検出と特性評価のための有用なテクニックです。ここでは、大規模なアプリケーションにこのテクニックは、従順になるの適応を示しています。

アミロイド凝集は数多くのタンパク質ミスフォールディング疾患に関連しており、プリオンの感染性の基盤となっている。プリオンとは...

こんにちは、MIT生物学科のSusan Linus研究室の大学院生、Randall Hoffmanです。今日は、半変性界面活性剤アガロースゲル電気泳動（SDD-AGE）についてご紹介します。私たちの研究室では、プリオンやその他のアミロイド原性タンパク質のスクリーニングにこの手法を用いています。当社のSDD ageの手法はシンプルで信頼性が高く、任意のサンプル数に合わせてスケールアップすることが可能です。アミロイドはSDSによる変性に極めて強い耐性を持つため、SDDHを用いることで他のタンパク質から分離できます。しかし、SDDHから得られたデータのみで、ある物質がアミロイドであると断定することはできません。そのためには、別の手法を用いる必要があります。それを踏まえて、実演いたします。S-D-D-H-S-D-D-Hは、標準的な水平DNA電気泳動装置を用いて実施可能です。まず、ゲルキャスティングトレーを組み立てます。装置のサイズは、サンプルの数によって異なります。サンプル数が多い場合は、20 by 24 cmのスラブと、最大4本の50ウェルコームを使用します。ゲルの調製には、中または高強度の低EEOアガロース、1×TAEバッファー、および10% SDSストック溶液が必要です。1.5% アガロース溶液と1×TAEを調製します。多くのサンプルをロードし、検出を最大化するために、ゲルはできるだけ厚く作ってください。アガロースが完全に溶解するまで、混合物を電子レンジで加熱します。100 XSDSストック溶液を0.1%に迅速に添加し、旋回させて混ぜ合わせます。このステップで一部が凝固した場合は、ホットプレートで溶解させてください。沸騰させないよう注意してください。SDSを添加すると溶液が容易に泡立ってしまうため、熱いうちにこの溶液をキャスティングトレイに注ぎます。次に、後のゲル転写時に妨げとなる可能性のある気泡を、コームを用いて取り除きます。ゲルが完全に冷却され固化した後、慎重にコームを取り外し、ゲルをタンクに設置します。ゲルを0.1% SDSを含む1× XTAEに完全に浸します。これでサンプルのロード準備が整いました。SDDHで使用するタンパク質サンプルは、2つの重要な例外を除いて、SDS-PAGEと同様に調製します。第一に、凝集塊がタンパク質モノマーに脱凝集する可能性があるため、サンプルの加熱は避けてください。第二に、タンパク質の分解を防ぐよう注意してください。本手法で用いる変性条件ではすべてのプロテアーゼを不活化させるには不十分であるため、推奨濃度の少なくとも2倍の完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用することを推奨します。本デモンストレーションでは、目的の特定のタンパク質を過剰発現させた酵母細胞のライセートを使用します。通常は、VWRから入手可能な96ウェルブロックを用い、2 mLの培養液で一晩培養します。ただし、低発現タンパク質を分析する場合は、より大きな培養量を使用する必要があります。培養液を室温で 2000 RCF で5分間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離後、上清を除去し、水を加えて再懸濁し、再度遠心分離して細胞を洗浄します。2回目の遠心分離後、上清を除去し、細胞を少量のプレート用溶液に再懸濁します。溶液中の酵素が細胞壁を消化するため、少量の溶解バッファーで効率的に細胞を溶解させることができます。30 °C で30分間インキュベートします。予備のプラスチック細胞を、今回は800 RCFで5分間遠心してペレット化します。上清を完全に除き、各ペレットを100 µLの溶解バッファーで再懸濁します。次に、ブロックをテープで覆い、高速で2分間ボルテックスします。これにより、4,000 RCFで2分間遠心分離し、すべてのプラスチックスフィアから細胞残渣を分離させます。その後、上清を慎重に96ウェルPCRプレートに移します。通常、当研究室では一度に数百個のサンプルを分析するため、液体ハンドリングシステムを用いて作業を効率化しています。必要に応じて、ライセートのタンパク質濃度を測定してください。次に、サンプルに4xサンプルバッファーを添加して1xサンプルバッファー濃度のライセートを作成し、室温で5分間インキュベートします。次に、サンプルをゲルにロードします。必要に応じて、サンプルの半分をSDS-PAGE解析用に保存しておきます。また、プレステインマーカーや、ニワトリのflector s抽出液のような超高分子量マーカーを含む分子量マーカーをロードします。必要に応じて、低分子量タンパク質の拡散を防ぐためにゲルを冷却することが重要であるため、低温室で電気泳動を行うことが推奨されます。ゲルの長さ1cmあたり3V未満の低電圧で泳動させてください。色素がゲルの末端から約1cmの位置に達するまで、数時間泳動します。アミロイドは室温の2%SDSでは変性しないため、2%SDSの存在下でほとんどの非アミロイド凝集体を含む他の複合体が解離しても、アミロイドはそのままの状態を維持します。したがって、ほとんどのタンパク質は単量体となり、ゲル内を速く移動します。一方で、SDS耐性を持つ高分子量アミロイドの移動速度はより遅くなります。これで、ゲルの転写準備が整いました。転写方法には複数の手法がありますが、毛細管転写を用いることで最良の結果が得られます。毛細管転写はあらゆるサイズのゲルに対応できるため、数百ものサンプルを分析する場合に実用的です。乾燥したブロッティングペーパーを重ねることで、緩衝液をゲルから吸い上げ、ペーパーとゲルの間に配置したニトロセルロース膜にタンパク質を転写させます。High Bond C Extraなどのニトロセルロースを、ゲルと同じ寸法に切り出してください。また、GBO 04ブロッティングペーパーを20枚、GBO 02ブロッティングペーパーを8枚、それぞれゲルと同じサイズに切り出しておく必要があります。GB 04は非常に厚く、吸収性に優れています。一方、GB 02はそれよりもずっと薄く、きめの細かい質感であるため、メンブレンとより均一に接触させることができます。芯として使用するためのGB 04を別途切り出し、浸漬させたゲルの幅よりも約20 cm広くしてください。プラスチック容器に、ニトロスUL WIC、GBO O₂ 4枚、およびXTBS 1枚を用意し、以下のようにフィルターを積層させます。まず、乾燥したGBO O₄を20枚重ねます。次に、乾燥したGBO O₂を4枚重ねます。最後に、あらかじめ濡らしておいたGBO O₂を1枚重ねます。このスタックの上にニトロセルロース膜を載せます。キャスティングトレー上のゲルを水で軽くすすぎ、余分なランニングバッファーを取り除きます。その後、必要に応じてTBSで膜を濡らしながら、ゲルをトレーから慎重に滑らせてスタックの上に移動させます。バッファーを多めに加えることで、ゲル内に気泡が閉じ込められるのを防ぐことができます。ゲルを完全にスタッキングゲル側に移動させた後、転送ピペットを使用するとこの操作に有効です。気泡が残っていないか十分に確認してください。ゲルの端を持ち上げ、気泡が抜けるまでバッファーを再度加えます。あらかじめ濡らしておいた残りの3枚のGBOoh 2片をゲルの上に載せます。ピペットでスタックの上部をしっかりと転がし、すべての層が完全に密着していることを確認してください。転写スタックの両脇にTBSを入れた2つの高さのあるトレイを配置し、あらかじめ濡らしたウィックをスタックにわたらせて、ウィックの両端がTBSに浸かるようにします。組み立てた転写スタックの上に、500 mLの水が入ったボトルなどの重りを載せたプラスチックトレイをさらに被せます。これにより、ウィックがトレイからバッファーを吸収し、乾燥したブロッティングペーパーが数時間かけてゲル内にバッファーを吸い上げます。これにより、タンパク質がメンブレン上に沈着します。転写を最低3時間、または一晩行わせてください。キャピラリー転写の完了後、メンブレンを標準的なウェスタンブロッティングの手順で処理できます。ここでは、特定のタンパク質がアミロイドを形成しやすい酵母株において過剰発現させたタンパク質の代表的なブロットを示します。ここで示しているものやこちらに示しているもののように、一部の候補物質はアミロイドまたは高分子量のSDS耐性種を非常に良好に形成していることが明確にわかります。一方で、これらやこれらのように、凝集体を形成せず完全に単量体であるものもあります。さらに、これら2つのレーンでわかるように、アミロイドポリマーのサイズはタンパク質によって異なることが見て取れます。プリオン候補物質のアミロイドなどの、高分子量で不溶性の凝集体を分析するための簡単な方法をご紹介しました。本プレゼンテーションがお役に立ち、免疫原性タンパク質の研究においてこの手法をご活用いただければ幸いです。ご視聴ありがとうございました。皆様の研究の成功をお祈りいたします。

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