セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

こんにちは。私はMIT生物学部、Susan Linus研究室の大学院生のRandall Hoffmanです。本日は、準変性界面活性剤アガロースゲル電気泳動（SDD-AGE）についてご紹介します。当研究室では、プリオンやその他のアミロイド形成タンパク質のスクリーニングにこの手法を用いています。

我々のSDD法のバージョンは簡便かつ信頼性が高く、任意のサンプル数に合わせてスケールアップが可能です。アミロイドはSDSによる変性に非常に強い耐性を持つため、SDDHを用いて他のタンパク質から分離することができます。しかし、SDDHから得られたデータのみで、ある物質がアミロイドであることを確定させることはできません。

そのためには、別の手法を用いる必要があります。それを踏まえて、説明しましょう。S-D-D-H-S-D-D-Hは、標準的な水平DNA電気泳動装置を用いて実施できます。

まず、ゲルキャスティングトレイを組み立てます。装置のサイズは、サンプルの数によって異なります。サンプル数が多い場合は、20 × 24 cmのスラブと、最大4本の50ウェルコームを使用します。

ゲルの調製には、中強度または高強度の低EEOアガロース、1X TAEバッファー、および10% SDSストック溶液が必要です。1.5% アガロース溶液と1X TAEを調製します。検体を最大限にロードし、検出感度を最大化するため、ゲルはできるだけ厚く作ってください。アガロースが完全に溶解するまで、混合物を電子レンジで加熱します。

100 XSDSストック溶液を0.1%に迅速に添加し、 swirlingして混ぜ合わせます。このステップで一部が凝固した場合は、ホットプレートで溶解させてください。沸騰させないように注意してください。

SDSを添加すると溶液が容易に泡立って溢れるため、熱いうちにこの溶液をキャスティングトレイに注ぎます。次に、後のゲル転写の妨げとなる気泡を除去するために、コームを使用して気泡を取り除きます。ゲルが完全に冷却され、凝固した後、慎重にコームを取り外し、ゲルをタンクに入れます。

ゲルを0.1% SDSを含む1× XTAEに完全に浸します。これでサンプルのロード準備が整いました。SDDHで使用するタンパク質サンプルは、2つの重要な例外を除いて、SDS-PAGEと同様に調製します。

まず、凝集体をタンパク質モノマーに脱自然化させてしまう可能性があるため、サンプルの加熱を避けてください。次に、タンパク質の分解を防ぐよう注意してください。本手法で用いる変性条件では、すべてのプロテアーゼを不活性化するには不十分であるため、推奨濃度の少なくとも2倍の完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用することをお勧めします。

このデモンストレーションでは、特定の目的タンパク質を過剰発現させた酵母細胞のライセートを使用します。通常は、VWR社製の96ウェルブロックを用いて、2 mLの培養液で一晩培養します。ただし、低発現タンパク質を分析する場合は、より大量の培養液を使用する必要があります。

培養液を室温で2000 RCFで5分間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離後、上清を除去し、細胞を水に再懸濁して再度遠心分離することで洗浄します。2回目の遠心分離後、上清を除去し、細胞を適切なプレート用溶液に再懸濁します。溶液中の酵素が細胞壁を消化し、少量の溶解バッファーで効率的に細胞を溶解できるようになります。30 °Cで30分間インキュベートします。

今回は、予備のプラスチック細胞を800 RCFで5分間遠心分離し、ペレット化します。上清を完全に除き、各ペレットを100 µLの溶解バッファーで再懸濁します。次に、ブロックをテープで覆い、高速で2分間ボルテックスします。

これにより、4,000 RCFで2分間遠心分離し、すべてのプラスチック球から細胞残渣を分離させます。上清を96ウェルPCRプレートに慎重に移します。

通常、当研究室では一度に数百のサンプルを分析するため、液体ハンドリングシステムを使用してこれを効率化しています。必要に応じて、ライセートのタンパク質濃度を決定してください。次に、サンプルに4×サンプルバッファーを加え、1×サンプルバッファーを含むライセートを作成し、室温で5分間インキュベートします。

次に、サンプルをゲルにロードします。必要に応じて、サンプルの半分をSDS-PAGE分析用に保存してください。また、プレステインマーカーや、ニワトリのflector s extractのような超高分子量マーカーを含む分子量マーカーもロードします。

必要に応じて、低分子量タンパク質の拡散を防ぐためにゲルを冷却することが重要であるため、低温室で電気泳動を行うことが望ましい。ゲルの長さ1cmあたり3V未満の低電圧で泳動させる。色素がゲルの端から約1cmのところまで到達するまで、数時間泳動を行う。

アミロイドは室温で2% SDSによって変性しないため、2% SDSの存在下でほとんどの非アミロイド凝集物を含む他の複合体が解離しても、アミロイドはそのまま維持されます。したがって、ほとんどのタンパク質は単量体となり、ゲル内を速く移動します。一方で、SDS耐性を持つ高分子量アミロイドの移動速度はより遅くなります。

これで、ゲルの転写準備が整いました。転写方法にはいくつかありますが、キャピラリー転写を用いることで最良の結果が得られます。キャピラリー転写はあらゆるサイズのゲルに対応できるため、数百ものサンプルを分析する場合に実用的です。

乾燥したブロッティングペーパーのスタックが緩衝液をゲルから引き抜き、ペーパーとゲルの間に配置されたニトロセルロース膜にタンパク質を転写させます。High Bond C Extraなどのニトロセルロースを、ゲルと同じ寸法にカットして用意してください。また、GBO 04ブロッティングペーパーを20枚、GBO 02ブロッティングペーパーを8枚、それぞれゲルと同じサイズにカットして用意する必要があります。

GB 04は非常に厚く、吸収性に優れています。一方、GB 02はかなり薄く、よりきめの細かい質感であるため、メンブレンへのより均一な接触が保証されます。芯として使用するためのGB 04をさらに1枚切り出し、浸漬させるゲルの幅よりも約20 cm広くします。

プラスチック容器に入れられたnitrous UL WIC、GBO 02 4枚、およびXTBS 1枚を用い、次のように紙を積み重ねます。まず、乾燥したGBO 04を20枚重ねます。次に、乾燥したGBO 02を4枚重ねます。最後に、あらかじめ湿らせたGBO 02を1枚重ねます。

このスタックの上にニトロセルロース膜を置きます。キャスティングトレー上のゲルを水で軽くすすぎ、余分な泳動バッファーを取り除きます。次に、ゲルをトレーからスタック上へ慎重に滑らせて移動させ、その際、必要に応じてTBSを膜に滴下しながら行います。

バッファーを多めに加えることで、ゲル内に気泡が閉じ込められるのを防ぐことができます。ゲルを完全にスタッキングの上に移動させた後、転送ピペットを使用するとこの操作に有効です。気泡が混入していないか、十分に確認してください。

ゲルの端を持ち上げ、気泡がなくなるまでバッファーを再度添加します。あらかじめ湿らせておいた残りの3枚のGBO oh twoピースをゲルの上に重ねます。スタックの上をピペットで強く転がし、すべての層が十分に密着していることを確認してください。

転写スタックの両側にTBSを入れた2つの底上げトレーを配置し、ウィックを事前に湿らせてから、両端が浸かるようにスタックにわたらせます。TBS中で、組み立てた転写スタックの上に、500 mLの水が入ったボトルなどの重りを載せたプラスチックトレーをさらに被せます。これにより、ウィックがトレーからバッファーを吸い上げ、乾燥したブロッティングペーパーが数時間かけてゲルにバッファーを透過させます。

これによりタンパク質がメンブレン上に沈着します。転写を最低3時間、または一晩進行させてください。キャピラリー転写が完了した後、メンブレンを標準的なウェスタンブロッティング法で処理できます。ここでは、特定のタンパク質がアミロイドを形成しやすい酵母株において過剰発現させたタンパク質の典型的なブロットを示します。

こちらとこちらの例に見られるように、候補物質の中にはアミロイドまたは高分子量のSDS耐性種を非常に良好に形成するものがあることが明確にわかります。一方で、こちらやこちらの例のように、凝集体を形成せず完全にモノマー状態で存在するものもあります。さらに、これら2つのレーンからわかるように、アミロイドポリマーのサイズはタンパク質によって異なることが見て取れます。

ここでは、候補プリオンのアミロイドのような、高分子量で不溶性の凝集体を分析するための簡単な方法を紹介しました。このプレゼンテーションがお役に立ち、この手法がアミロイド免疫原性タンパク質の研究に有用であることを願っております。ご視聴ありがとうございました。皆様の研究の成功をお祈りいたします。