げっ歯類で存続可能な定位手術

こんにちは。タフツ大学医学部薬理学・実験治療学部のEmmanuel POTOs研究室のBrenda Geigerです。そして、同じ研究室のLauren Frankです。本日は、げっ歯類における生存可能な定位固定手術について実演します。

本手順では、器具の設置、手術に向けた動物の準備を行い、その後、定位固定手術を実施します。それでは始めていきましょう。手順を開始する前に、定位固定装置および必要なすべての材料を準備してください。

作業エリアおよび器具が洗浄・滅菌されていることを確認してください。次に、動物の手術準備を行います。本日の手術では、10週齢のSprague Dawleyラットを用いて実演します。

また、3ヶ月齢のSprague Dawleyラットと、専用のプラットフォームアダプターを必要とする2ヶ月齢のC57BL/6Jマウスを使用します。ケタミン60 mg/kgおよびキシラジン10 mg/kgを含むカクテル剤を腹腔内投与して、ラットを麻酔させます。サーモスタット制御のヒートパッドを使用して、動物の体温を維持してください。

動物が鎮静され、適切な体温で安定していることを確認した後、手術に進みます。手術を開始するには、電動バリカンを使用して、耳から両目の間まで動物の被毛を剃ります。剃毛した部位にヨードを塗布しますが、その際、目に塗布液が入らないよう注意してください。

次に、動物を脳定位固定装置に固定します。まず、片側のイヤーバーを外耳道に挿入し、そのまま固定した状態で、もう一方のイヤーバーを滑り込ませます。これにより、頭部が左右に動かないようにし、吻部が上下に動く状態にします。頭部が水平であることを確認しながら、脳定位固定装置のルーラーの前方マウントで口元を固定します。

定規と動物の頭皮の中央が90度の角度になるようにします。動物を固定したら、滅菌済みのメスを使用して頭皮に前後方向の切開を加えます。切開をラムダ点から動物の両目の間まで広げます。

止血鉗子を用いて皮膚を挟み、切開部を開いた状態に保持します。露出した頭蓋骨表面を数本の綿棒で拭き取ります。次に、ガイドカニューレをマウントに取り付けます。

次に、頭蓋骨上のbgmaを確認し、その位置の直上にガイドカニューレを配置します。bgmaからの前方、後方、および外側の座標を記録してください。プローブの設置に必要な正しい座標を確認します。

定位脳地図を用いて、bgmaから加減算することでガイドカニューレを正しい座標に配置します。ガイドカニューレを頭蓋骨に接触するまで下げ、その腹側座標を記録します。頭蓋骨のこの位置に鉛筆で印を付けます。

ここがドリリングを行う位置です。ドリリングを開始するには、ガイドカニューレを抜き、ドリルビットを滅菌してください。

次に、鉛筆で印を付けた箇所に0.5 mmの穴を、頭蓋骨の幅を貫通するまで開けます。ガイドカニューレを使用して、側壁に触れることなく穴を通過できるか確認してください。カニューレが直線的に穴を通過できるようになるまで、穿孔と確認を繰り返します。

髄膜や血管を貫通させないように注意してください。穴を開けた後、滅菌済みの針を使用して髄膜をそっと突き刺し、ガイドカニューレが妨げなく挿入できるようにします。次に、ハンドドリルを使用して、頭蓋骨ネジ用の穴を6か所開けます。

カニューレ孔の前方に2本、側方に2本、後方に2本のネジを配置します。6本のステンレス製骨ネジを滅菌し、頭蓋骨にしっかりと固定されるまで締め込みます。ネジの挿入後、ガイドカニューレをエタノールで洗浄して乾燥させ、その後ガイドを装着し、適切な腹側座標までゆっくりと降ろします。

脳への損傷を防ぐため、カニューレを上下に動かしながら挿入します。側面が接触していないこと、および完全に垂直に挿入されていることを確認してください。その後、止血鉗子を取り除きます。

歯科用セメントを薄く混ぜ合わせ、スパチュラを用いてガイドカニュラ、ネジ、および頭蓋骨の残りの部分を薄い層で覆います。次に、アンカースクリューを後方の頭蓋骨ネジの後方かつ内側に配置し、ピンセットで固定します。再度セメントを調製し、今度は厚めに混ぜ合わせ、セメントが硬化した際にカニュラとアンカースクリューを十分に固定できるよう、それらを完全に覆います。

ただし、凝固する前に、皮膚からセメントキャップを分離し、スパチュラでセメントキャップを成形して、周囲が滑らかであり、皮膚を刺激しないようにします。その後、さらにセメントを追加してガイドカニューレを補強し、ヘッドマウントの残りの部分と接合させます。歯科用セメントが完全に乾燥した後、動物を装置から取り出します。

その後、セメントキャップの周囲全体に局所抗生物質のバシトラシンを塗布します。次に、ペニシリンを筋肉内注射し、続いて生理食塩水を皮下注射します。動物をケージに戻し、意識が回復するまで観察します。

その後、動物をケージに戻して回復させます。回復後、実験終了まで、感染の兆候がないか、また痛みや苦痛の状態について毎日観察を行います。

動物に疼痛があると思われる場合は、ブプレノルフィン0.1〜0.5 mg/kgを1日2回、必要に応じて皮下投与する。さらに、局所的なバシトラシン治療および全身的なペニシリン治療を行う。術後感染症が発生した場合、または術後12時間以上にわたって症状が持続する場合は、動物を安楽死させる。

以上で、げっ歯類における生存可能な定位固定手術の手順を説明しました。この操作を行う際は、感染を防ぐために手術中に無菌環境を維持し、術後の動物を注意深く観察することが重要です。また、ガイドカニューレの挿入位置を正確にするため、動物を耳棒に正しく固定してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。