胸腺文化を再集合させる
August 28th, 2008
このビデオでは胸腺の文化を再集合させる2 - dGuo処理したの準備が示されている。
こんにちは、私はアンドレア・ホワイトで、バーミンガム大学のMRC免疫調節センターのグラハム・アンダーソンとエリック・ジェンキンソンの研究室から来ました。本日は、T細胞の分化中に発生する複雑な細胞相互作用を研究するために使用できる、再凝集胸腺臓器培養を導出するためのプロトコルを紹介します。この手順の開始に先立ち、胚胸腺葉を分離し、すべてのリンパ球を除去するために治療しました。
これは別のビデオで見ることができます。次に、エイリアンノイドローブを分解して、間質細胞調製物を生成します。そして最後に、細胞を凝集させて再凝集体器官培養を形成します。
さぁ、始めよう。培養の5から7日後、LOは浅瀬の細胞の準備のためにdisaggregateするために準備ができているべきです RPMI 1640プラス10%FCSを含んでいるシャーレに0.8マイクロメートルのフィルターを沈めます 鉗子を使用して、浮かばない繊維の斜面を穏やかに押し出します。ペット1匹あたり1ミルを使用して、ローブを1.5ミルのオーフェンドチューブに移します。
オーフチューブあたり50ローブ以下をお勧めします。単位重力下でローブがチューブの底に落ち着くのを待ち、媒体を取り除きます。ローブを1ミルPBSで洗い、ローブを再び底に沈めます。
これを合計3回のPBS洗浄で繰り返し、最後のPBS洗浄液を取り出し、溶液中の0.25%tripsを600マイクロリットル加えます。アイノールチューブを37度のインキュベーターに25分間置きます。1ミルブルーの先端をパーペットに10秒間静かに三分し、20分後にインキュベーターに戻し、ローブを上下にピペッティングして完全に分解します。
それは単一の細胞懸濁液を達成するために、400マイクロリットルの氷冷、RPMI 1640プラス10%FCSを加えてトリプシンimpの餌を中和するために1000 RPMで遠心分離によって細胞を中和するために、4°Cで10分かかるべきである、supのnatantを取除き、1ミルの餌を再懸濁する。RPMI 1640 と必要に応じて 10% FCS 。セルをカウントします。
通常、ジオキサジンローブあたり約50, 000個の細胞が、E 15繊維状から始まります。これで、1.5ミルのオーフェンドチューブで凝集体fmicコーガン培養を形成する準備が整いました。混合された、新たに調製された微細な間質細胞。
事前に選択されたCDとともに、4つの陽性CD8つの陽性線維細胞。間質細胞と線維細胞の比率は約1対1を推奨します。使用する細胞の数は、利用可能な細胞の数と実施する実験によって異なります。
合計で 10 万個以上、150 万個以下のセルをお勧めします。V凝集体は再現性のある大きさにする必要がありますが、中心が1000 RPMで10分間遠心分離してペレット細胞を死滅させるほど大きくはなりません。4°Cで、臓器培養フィルターを慎重に組み立てます。
すべてのSUPナチンを取り外すtageペットあたり200ペソ。ボルテックスセルペレットを10秒間かけてスラリーを形成します。容量は約1〜2マイクロリットルの口である必要があります。
スラリーを細かく描かれたペットに撫で、細胞の懸濁液をペットの先端に保ちます。当社の解剖顕微鏡で、細胞スラリーを0.8マイクロメートルフィルターの中心に慎重にPETします。理想的には、細胞は直径1〜2ミリメートルの円の中に立っている滴として配置する必要があります。
スラリーが広がり始めたら、残りの細胞を堆積させる前に、スラリー中の液体がposを通って排出されるのを待ちます。プラスチック製のサンドイッチボックスに皿を入れて密封します。胸腺器官の培養については、インキュベーターに箱を入れて、培養後18時間以内に培養物を無傷の構造に凝集させます。
4〜5日間の培養後、CD 4陽性8陰性およびCD 4陰性8陽性成熟細胞サブセットの両方が生成されます。50ジオキサジン処理されたローブから始めて、3〜5個の再凝集体培養を準備するのに十分な間質細胞が得られるはずです。これらの培養物は通常、細胞のコヒーレントなマウンドとして現れ、鉗子を使用してフィルターから押し出すことができます。
F上皮細胞による正の選択を研究する方法について説明しました。この方法は、樹状細胞を介したネガティブセレクションの研究にも使用できます。最後に、TCRトランスジェニックFIBROCYTESまたはMHCクラス1欠損またはMHCクラス2欠損間質細胞を使用します。
このシステムでは、CD 4陽性またはCD 8陽性T細胞の選択を別々に調査できます。ご視聴いただきありがとうございます。
概要
このビデオは、2-dGuoで処理された再集合胸腺培養物の準備を示しています。これらの培養物は、T細胞の分化と細胞間相互作用を研究するために不可欠です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 胸腺器官培養
背景
- 胸腺器官培養は、T細胞の発達を研究するために使用されます。
- 再集合培養は細胞間相互作用の検討を可能にします。
- 2-dGuo処理は胸腺葉の準備に利用されます。
- T細胞分化の理解は免疫学研究にとって重要です。
研究の目的
- 再集合胸腺器官培養を導出すること。
- T細胞分化プロセスを調査すること。
- 制御された環境で細胞間相互作用を探索すること。
使用された方法
- 胚性胸腺葉の分離と処理。
- 間質細胞調製を生成するための分解。
- 再集合培養を形成するための細胞の集合。
- 培養発達のインキュベーションと観察。
主な結果
- 再集合培養は18時間以内に完全な構造を形成します。
- CD4陽性とCD8陽性のT細胞サブセットが生成されます。
- この方法は正選択と負選択の研究を可能にします。
- さらなる調査のためにTCRトランスジェニック線維芽細胞の利用。
結論
- このプロトコルはT細胞分化を効果的に示します。
- 再集合培養は免疫学研究のための貴重なツールを提供します。
- さらなる研究は様々なT細胞選択研究のためにこの方法を利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of stromal compartment roles in T-cell development and selection.
- Enables functional validation of candidate targets involved in thymic microenvironment signaling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects of specific cell types or genetic backgrounds.
- Provides a platform for hypothesis-driven manipulation of thymic selection processes.
Screening & Assay Development
- Generates reproducible three-dimensional cultures for standardized functional assays.
- Allows quantitative assessment of T-cell subset differentiation under defined conditions.
- Supports assay development for evaluating modulators of thymic selection or stromal function.
- Enables scalable preparation of organotypic cultures for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant thymic microenvironments for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanisms of T-cell selection.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo immune development processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal-hematopoietic interactions and pathway elucidation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organotypic cultures for functional evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of T-cell subset generation and selection outcomes.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant immune development and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse genetic backgrounds and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes three-dimensional culture preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional roles of thymic compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to cell separation, counting, and organ culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell ratios and culture conditions for reproducibility.
- Adaptable to various genetic models, including transgenic or MHC-deficient backgrounds.
- Limited by the scalability of primary tissue sourcing and manual aggregation steps.
