胸腺文化を再集合させる
2008年8月28日
このビデオでは胸腺の文化を再集合させる2 - dGuo処理したの準備が示されている。
こんにちは、私はAndrea Whiteです。バーミンガム大学MRC免疫調節センターのGraham AndersonおよびEric Jenkinsonの研究室に所属しています。本日は、T細胞分化中に起こる複雑な細胞間相互作用の研究に利用できる、再凝集胸腺器官培養の誘導プロトコルをご紹介します。本手順を開始する前に、胚胸腺葉を単離し、すべてのリンパ球を除去する処理を行っておいてください。
これは別のビデオで確認できます。次に、エイリノイド葉を分散させて基質細胞調製物を作成します。そして最後に、細胞を凝集させて再凝集fmic器官培養を形成します。
それでは開始します。5〜7日間の培養後、shoal細胞調製のためにLOを分散させる準備が整います。0.8 µmフィルターを、RPMI 1640に10% FCSを添加した液体を含むペトリ皿に浸します。ピンセットを用いて、自然に剥離しない繊維状の凝集塊を優しく押し出します。1 mLピペットを使用して、葉状組織を1.5 mLエンドルフィチューブに移します。
エンドリブチューブ1本あたり50個分までの葉（lobe）の使用を推奨します。重力下で葉がチューブの底に沈殿するまで待ち、培地を除去します。1 mLのPBSで葉を洗浄し、再び葉が底に沈むまで待ちます。
この操作を合計3回のPBS洗浄まで繰り返し、最後のPBS洗浄液を除去した後、0.25%トリプシン溶液を600 µL加えます。エッペンドルフチューブを37 °Cのインキュベーターで25分間静置します。ピペットマンに1 mLのブルーチップを装着し、葉を10秒間緩やかにピペッティングします。その後、再度インキュベーターに戻し、20分後に葉を吸い上げ、完全に分散させます。
単一細胞懸濁液を調製するには、まず、トリプシンを中和させるために、氷冷した10% FCS含有RPMI 1640を400 µL添加します。その後、4°C、1,000 RPMで10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。必要に応じて、ペレットを1 mLの10% FCS含有RPMI 1640で再懸濁してください。最後に細胞数をカウントします。
通常、E 15の胚から開始した場合、ジオキサジン葉あたり約 50,000 個の細胞が期待されます。これで、1.5 mLのエッペンドルフチューブ内で凝集fmic Corgan培養を形成する準備が整いました。新鮮に調製した線維芽細胞を混合します。
あらかじめ選択したCD4陽性CD8陽性フィブロサイトと共に使用します。ストローマ細胞とフィブロサイトの比率は、約1:1を推奨します。使用する細胞数は、利用可能な細胞数および実施する実験内容によって異なります。
合計で少なくとも10万個、最大で150万個の細胞を使用することを推奨します。V凝集塊が再現性を得られるのに十分な大きさでありつつ、中心部が死滅しない程度の大きさにすることが重要です。1,000 RPMで10分間遠心分離を行い、細胞をペレット化します。4°Cで、器官培養フィルターを慎重に組み立ててください。
P200ピペットを用いて、ステージ上の上清をすべて取り除きます。細胞ペレットを10秒間ボルテックスしてスラリー状にします。液量は約1～2 µLになるはずです。
スラリーを細く絞ったピペットに吸い込み、細胞懸濁液をピペットの先端に保持させます。実体顕微鏡下で、細胞スラリーを0.8 µmフィルターの中央に慎重に滴下します。理想的には、細胞を直径1～2 mmの円状に盛り上がるドロップとして配置してください。
スラリーが広がり始めた場合は、残りの細胞を播種する前に、スラリー中の液体をposを通して排出し切ってください。ディッシュをプラスチック製のサンドイッチボックスに入れ、密封します。胸腺オルガン培養と同様に、ボックスをインキュベーターに入れます。凝集培養では、培養開始から18時間以内に完全な構造体が形成されます。
4〜5日間の培養後、CD4陽性CD8陰性とCD4陰性CD8陽性の両方の成熟T細胞サブセットが生成されます。50個のジオキサジン処理済み葉から開始すれば、3〜5個の再凝集培養を調製するのに十分な間質細胞が得られるはずです。これらの培養物は通常、細胞が凝集した塊として現れ、ピンセットを用いてフィルターから剥離させても崩れることなく回収できます。
以上で、F上皮細胞による正の選択を研究する方法について説明しました。この手法は、樹状細胞が介在する負の選択の研究にも利用可能です。さらに、TCRトランスジェニックFIBROCYTES、あるいはMHCクラスI欠損またはMHCクラスII欠損のストローマ細胞を用いることで、研究をさらに進めることができます。
このシステムにより、CD4陽性またはCD8陽性T細胞選択に関する個別の調査が可能です。ご視聴ありがとうございました。
概要
このビデオでは、2-dGuoで処理した胸腺再凝集培養物の調製方法を解説します。これらの培養物は、T細胞の分化および細胞間相互作用の研究に不可欠です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 胸腺器官培養
背景
- 胸腺器官培養は、T細胞の発達を研究するために用いられます。
- 再凝集培養により、細胞間相互作用の検討が可能になります。
- 胸腺葉の調製には、2-dGuo処理が利用されます。
- T細胞分化の理解は、免疫学的研究において極めて重要です。
研究目的
- 再凝集胸腺器官培養系を構築すること。
- T細胞の分化過程を調査すること。
- 制御された環境下で細胞間相互作用を探索すること。
使用された手法
- 胚性胸腺葉の単離および処理。
- ストローマ細胞調製液を作成するための細胞分散。
- 細胞を凝集させ、再凝集培養物を形成。
- 培養物の発育に関するインキュベーションおよび観察。
主要な結果
- 再凝集培養により、18時間以内に完全な構造が形成される。
- CD4陽性およびCD8陽性のT細胞サブセットが生成される。
- 本手法により、ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションの研究が可能となる。
- さらなる調査のために、TCRトランスジェニック線維細胞を利用できる。
結論
- 本プロトコルは、T細胞分化を効果的に実証しています。
- 再凝集培養は、免疫学的研究において有用なツールとなります。
- 今後の研究では、この手法をさまざまなT細胞選択研究に活用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
胸腺再凝集培養を用いることで、T細胞の系統決定および選択に不可欠な間質細胞と造血細胞の相互作用を精密に解析することが可能になります。この3次元in vitroシステムは、細胞組成や微小環境の制御された操作を可能にすることで、ターゲットバリデーション段階におけるメカニズムのデリスキングを支援します。このアプローチは、胸腺選択および自己・非自己識別の主要な側面をモデル化することで、免疫学に焦点を当てた創薬ポートフォリオの予測信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- T細胞の発達および選択におけるストローマコンパートメントの役割の解析を促進します。
- 胸腺微小環境のシグナル伝達に関与する候補ターゲットの機能的な検証を可能にします。
- 特定の細胞型や遺伝的背景の影響を分離することで、メカニズム的なリスク軽減をサポートします。
- 仮説に基づいた胸腺選択プロセスの操作のためのプラットフォームを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 標準化された機能解析のための、再現性の高い三次元培養系を構築する。
- 規定の条件下におけるT細胞サブセット分化の定量的な評価を可能にする。
- 胸腺選択またはストローマ細胞機能のモジュレーターを評価するためのアッセイ開発を支援する。
- 後続のスクリーニングワークフローに向けた、器官類似培養のスケールアップ可能な調製を可能にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー探索に向けた、疾患に関連する胸腺微小環境をモデル化します。
- 免疫調節介入の発見から前臨床検証までの連続性を確保します。
- T細胞選択のメカニズムを明らかにすることで、リスク調整に基づいた推進決定を可能にします。
- in vitroでの知見とin vivoでの免疫発達プロセスの整合性をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、生理学的に関連のある文脈において胸腺選択メカニズムの制御された定量的な研究を可能にすることで、初期の発見から前臨床研究への橋渡しを行います。
- 探索生物学： ストローマ細胞と造血細胞の相互作用に関する仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 機能評価に適した、アッセイに使用可能な再現性のある器官型培養系を提供します。
- 分析： T細胞サブセットの生成および選択結果の定量的リードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの知見を、疾患に関連する免疫発達およびバイオマーカーの同定に適合させます。
- エンタープライズ再利用： 多様な遺伝的背景や実験変数に適応可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：免疫標的バリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：再現性と拡張性のための三次元培養調製を標準化します。
- 戦略的価値：胸腺コンパートメントの機能的な役割を明確にすることで、Go/No-go決定に根拠を与えます。
- ポートフォリオへの影響：免疫調節候補物質のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 胚組織の取り扱いおよび三次元培養技術に関する専門知識が必要です。
- 細胞分離、カウント、および器官培養のための設備へのアクセスが必要です。
- 再現性を確保するため、細胞比率および培養条件のチーム間での標準化が求められます。
- トランスジェニックやMHC欠損背景を含む、さまざまな遺伝子モデルに適応可能です。
- 一次組織の調達能力および手動による凝集ステップの拡張性に制約があります。
