Name: 胸腺文化を再集合させる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶ胸腺再集合培養法によるT細胞分化と細胞間相互作用の研究。2-dGuo処理した胎生胸腺葉を解離・再集合させ、CD4陽性およびCD8陽性T細胞サブセットの生成を観察します。この方法は免疫学研究における陽性選択と陰性選択の解析に有用です。

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胸腺の文化をreggregateの準備の詳細についてはをご覧ください<a href="http://www.springerprotocols.com/">シュプリンガープロトコルを</a> 。

著者らに開示すべき事項はありません。

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

胸腺文化を再集合させる

Reaggregate Thymus Cultures

胸腺では、未熟なCD4 8 +ランダムに並び替えT細胞受容体α-およびB鎖の遺伝子を発現する胸腺細胞は、胸腺で表さself-peptide/majorの組織適合性複合体（MHC）分子を認識する能力に基づいて正と負の選択イベントを受ける間質細胞。胸腺内選択中の胸腺間質細胞の役割のin vivo解析では定常状態の成人の胸腺における胸腺微小環境の細胞の複雑さによって困難さ、および適切なターゲット戦略の欠如により、特定の胸腺間質コンパートメントにおける遺伝子発現を操作する。我々は胸腺微小環境を容易に定義されている間質およびリンパ系細胞から三次元胸腺葉の準備を可能に再集合させる胸腺器官培養、を使用してin vitroで操作できることを示している。 in vitro系で他はT細胞の開発のいくつかの側面をサポートしていますが、胸腺器官培養は、IとIIを介した胸腺細胞選択イベント、などを勉強するために有効なツールとして使用できる唯一の​​in vitroの系での効率的なMHCクラスをサポートすることが残って再集合させる胸腺で正と負の選択の細胞および分子調節。

このビデオでは胸腺の文化を再集合させる2 - dGuo処理したの準備が示されている。

リンパ組織内のストローマ細胞は三次元構造に組織化されており、それが足場となって、細胞の遊走や...を制御していると考えられています。

こんにちは、私はAndrea Whiteです。バーミンガム大学MRC免疫調節センターのGraham AndersonおよびEric Jenkinsonの研究室に所属しています。本日は、T細胞分化中に起こる複雑な細胞間相互作用の研究に利用できる、再凝集胸腺器官培養の誘導プロトコルをご紹介します。本手順を開始する前に、胚胸腺葉を単離し、すべてのリンパ球を除去する処理を行っておいてください。これは別のビデオで確認できます。次に、エイリノイド葉を分散させて基質細胞調製物を作成します。そして最後に、細胞を凝集させて再凝集fmic器官培養を形成します。それでは開始します。5〜7日間の培養後、shoal細胞調製のためにLOを分散させる準備が整います。0.8 µmフィルターを、RPMI 1640に10% FCSを添加した液体を含むペトリ皿に浸します。ピンセットを用いて、自然に剥離しない繊維状の凝集塊を優しく押し出します。1 mLピペットを使用して、葉状組織を1.5 mLエンドルフィチューブに移します。エンドリブチューブ1本あたり50個分までの葉（lobe）の使用を推奨します。重力下で葉がチューブの底に沈殿するまで待ち、培地を除去します。1 mLのPBSで葉を洗浄し、再び葉が底に沈むまで待ちます。この操作を合計3回のPBS洗浄まで繰り返し、最後のPBS洗浄液を除去した後、0.25%トリプシン溶液を600 µL加えます。エッペンドルフチューブを37 °Cのインキュベーターで25分間静置します。ピペットマンに1 mLのブルーチップを装着し、葉を10秒間緩やかにピペッティングします。その後、再度インキュベーターに戻し、20分後に葉を吸い上げ、完全に分散させます。単一細胞懸濁液を調製するには、まず、トリプシンを中和させるために、氷冷した10% FCS含有RPMI 1640を400 µL添加します。その後、4°C、1,000 RPMで10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。必要に応じて、ペレットを1 mLの10% FCS含有RPMI 1640で再懸濁してください。最後に細胞数をカウントします。通常、E 15の胚から開始した場合、ジオキサジン葉あたり約 50,000 個の細胞が期待されます。これで、1.5 mLのエッペンドルフチューブ内で凝集fmic Corgan培養を形成する準備が整いました。新鮮に調製した線維芽細胞を混合します。あらかじめ選択したCD4陽性CD8陽性フィブロサイトと共に使用します。ストローマ細胞とフィブロサイトの比率は、約1:1を推奨します。使用する細胞数は、利用可能な細胞数および実施する実験内容によって異なります。合計で少なくとも10万個、最大で150万個の細胞を使用することを推奨します。V凝集塊が再現性を得られるのに十分な大きさでありつつ、中心部が死滅しない程度の大きさにすることが重要です。1,000 RPMで10分間遠心分離を行い、細胞をペレット化します。4°Cで、器官培養フィルターを慎重に組み立ててください。P200ピペットを用いて、ステージ上の上清をすべて取り除きます。細胞ペレットを10秒間ボルテックスしてスラリー状にします。液量は約1～2 µLになるはずです。スラリーを細く絞ったピペットに吸い込み、細胞懸濁液をピペットの先端に保持させます。実体顕微鏡下で、細胞スラリーを0.8 µmフィルターの中央に慎重に滴下します。理想的には、細胞を直径1～2 mmの円状に盛り上がるドロップとして配置してください。スラリーが広がり始めた場合は、残りの細胞を播種する前に、スラリー中の液体をposを通して排出し切ってください。ディッシュをプラスチック製のサンドイッチボックスに入れ、密封します。胸腺オルガン培養と同様に、ボックスをインキュベーターに入れます。凝集培養では、培養開始から18時間以内に完全な構造体が形成されます。4〜5日間の培養後、CD4陽性CD8陰性とCD4陰性CD8陽性の両方の成熟T細胞サブセットが生成されます。50個のジオキサジン処理済み葉から開始すれば、3〜5個の再凝集培養を調製するのに十分な間質細胞が得られるはずです。これらの培養物は通常、細胞が凝集した塊として現れ、ピンセットを用いてフィルターから剥離させても崩れることなく回収できます。以上で、F上皮細胞による正の選択を研究する方法について説明しました。この手法は、樹状細胞が介在する負の選択の研究にも利用可能です。さらに、TCRトランスジェニックFIBROCYTES、あるいはMHCクラスI欠損またはMHCクラスII欠損のストローマ細胞を用いることで、研究をさらに進めることができます。このシステムにより、CD4陽性またはCD8陽性T細胞選択に関する個別の調査が可能です。ご視聴ありがとうございました。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、解剖や胎児の胸腺の除去だけでなく、2 - dGuo処理胸腺のex...

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

このビデオでは、iPS細胞由来の未熟T細胞から、三次元胸腺培養システムを用いて機能的な抗原特異的T細胞を作製するプロトコールを実演しています。iPS細胞由来の未成熟T細胞を内因性リンパ球枯渇マウスの胎児胸腺葉と共培養した結果、T細胞の成熟に成功し、CD8αβ+ MHCクラスI+...

iPS細胞由来胸腺移民を作出する3次元胸腺培養システム

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。...

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。...

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

現在の2D培養システムはin vivoのシナリオを模倣していないため、in...

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

この記事では、胸腺沈降前駆細胞を特徴づけるためのin vivoおよびin vitroの方法論について、そのT細胞子孫の世代数、表現型、および数の動態を分析することによって説明しています。...

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

このビデオは、FACS単離のための密度勾配で胸腺上皮細胞（TEC）を濃縮するプロトコールを示しています。また、EAK16-II/EAKIIH6ペプチドを使用してTEC凝集体の形成を促進する様子も示しています。EAK16-II/EAKIIH6ハイドロゲルの微小環境は、TECの生存と機能を維持するために必要な3D構成を提供します。...

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

我々は、フローサイトメトリーと組み合わせて、T細胞の開発の正および負の選択をモデル化するために使用することができ、胸腺切片の調製を記載します。胸腺スライスはまた胸腺細胞遊走、局在のその場での分析のために適合され、そして免疫蛍光及び二光子顕微鏡検査を介してシグナル伝達することができます。...

調製及び器官胸腺スライス培養の応用

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

このプロトコルでは、マウス胸腺からのダブルネガティブ胸腺細胞の単離とそれに続くレトロウイルス形質導入、およびさらなる機能分析のためのデルタ様4発現骨髄間質細胞株共培養システム(OP9-DL4)での共培養について説明します。...

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

ここでは、胸腺上皮細胞(TEC)の成熟と長期維持、およびin...

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

学ぶ胸腺再集合培養法によるT細胞分化と細胞間相互作用の研究。2-dGuo処理した胎生胸腺葉を解離・再集合させ、CD4陽性およびCD8陽性T細胞サブセットの生成を観察します。この方法は免疫学研究における陽性選択と陰性選択の解析に有用です。

胸腺文化を再集合させる

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