Name: 2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぶ胎児胸腺器官培養の準備と2-dGuo処理によるリンパ球除去法。マウス胚からの胸腺摘出、培養条件の設定、T細胞発生のin vitro研究への応用を解説。免疫学研究に有用な技術です。

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をご覧ください<a href="http://www.springerprotocols.com/">シュプリンガープロトコルを</a> ex vivoでの胸腺の器官培養の準備の詳細については。

著者に開示すべき事項はありません。

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2 - dguo処理した胸腺器官培養の準備

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

胸腺では、未熟なCD4 8 +ランダムに並び替えT細胞受容体α-およびB鎖の遺伝子を発現する胸腺細胞は、胸腺で表さself-peptide/majorの組織適合性複合体（MHC）分子を認識する能力に基づいて正と負の選択イベントを受ける間質細胞。胸腺内選択中の胸腺間質細胞の役割のin vivo解析では定常状態の成人の胸腺における胸腺微小環境の細胞の複雑さによって困難さ、および適切なターゲット戦略の欠如により、特定の胸腺間質コンパートメントにおける遺伝子発現を操作する。我々は胸腺微小環境を容易に定義されている間質およびリンパ系細胞から三次元胸腺葉の準備を可能に再集合させる胸腺器官培養、を使用してin vitroで操作できることを示している。 in vitro系で他のT -細胞の発達のいくつかの側面をサポートしていますが、胸腺器官培養は、IとIIを介した胸腺細胞選択イベント、などがstudyに有効なツールとして使用できる唯一の​​in vitroの系での効率的なMHCクラスをサポートすることが残っているreaggregate胸腺で正と負の選択の細胞および分子調節。

このビデオでは、解剖や胎児の胸腺の除去だけでなく、2 - dGuo処理胸腺のex vivoでの培養の準備を示しています。

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

胸腺において、分化中のT細胞前駆細胞と、皮質および髄質の上皮細胞を含むストローマ細胞との相互作用が、...を果たすことが知られています。

こんにちは。バーミンガム大学MRC免疫調節センターのGraham AndersonおよびEric Jenkinsonの研究グループに所属しているWill Jenkinsonです。本日は、胎児胸腺オルガン培養をセットアップする手法をご紹介します。さらに、これらのオルガン培養に2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン（TCDD）を処置する方法についても解説します。そして、これは器官培養におけるリンパ系細胞に対して選択的な毒性を持つ物質です。この手法は研究室でいくつかの用途に活用されており、その一つに再凝集器官培養の作製があります。その他の応用例としては、細胞分化のさまざまな段階の研究が挙げられます。胎児胸腺オルガン培養を用いることで、さまざまな経路を抑制または刺激する試薬を添加することができ、このプロセスにおける特定の分子の役割を研究することが可能です。それでは始めましょう。胸腺オルガン培養を準備するための最初のステップは、1〜2匹の妊娠マウスから胚齢14日または15日のマウス胚を採取することです。まず、安楽死させたマウスに70% ethanolをスプレーします。次に、ピンセットで被毛を引っ張り、膀胱から子宮の両側角に向かって、腹部にV字型の切開をハサミで行います。子宮角を取り出し、滅菌済みの10 centimeterペトリ皿に入れます。子宮壁の長さに沿って切開し、羊膜嚢に入ったままの胚を取り出します。2本の精細鑷子を用いて、10 mLのPBSを入れたペトリ皿の中で胚を洗浄します。慎重に羊膜嚢を切り開き、嚢と胎盤から胚を分離させます。次に、PBSと10% FCS含有RPMI 1640を50:50で混合した10 mLの溶液が入った新しいペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡下で、胚を培地に浸したまま、鉗子を用いて胚を切り離します。閉じた状態の鉗子の先端を胸腔に挿入し、鉗子を開いて胸壁の前表面を開き、胸腔内部を露出させます。心臓の下をそっと掴んで、胸管、心臓、肺、気管、および胸腺をすべて取り出し、5 mLのRPMI 1640（10% FCS添加）が入った35 mmディッシュに移します。14〜15日の胚を用います。未発達な胸腺葉は、ここにある気管の両側で心臓の直上に位置しています。精密ピンセットを用いて個々の胸腺葉を取り除き、さらに過剰な結合組織と付着した血液を除去してから、器官培養へと展開します。これで器官培養の準備が整いました。リンパ球解毒を行うため、9 mMの2-ドキシザジンストック溶液を用い、90 mmの細菌用プラスチックペトリ皿に600 µLを分注して準備します。あらかじめ温めておいたDMEM培地を4 mL加え、ディッシュを回転させて表面全体に培地が行き渡るようにします。当然ながら、T細胞の発達を研究するためのリンパ球培養を行う場合は、ピンセットを使用して2つのジオキサジンを除去してください。1 cm²にプリカットした滅菌済みのアートラップスポンジ2枚をディッシュに入れます。培地をスポンジに約30秒間浸透させます。次に、スポンジを裏返して両面を濡らします。その後、再びピンセットを用いて、ディッシュ内の培地が組織に接するようにします。あらかじめ滅菌した0.8 micronフィルターを各スポンジの表面に配置します。胸腺組織を臓器培養フィルターに転移させるため、フィルターの光沢のある面を上にしてスポンジサポートの上に置きます。ガラスピペットの作製には、マッチコントロールガラスピペットを使用します。ブンゼンバーナーの炎でガラス管を加熱し、ガラスが可塑性を持ったところで炎から外し、両端を引いてガラスを10 centimeters以下に伸ばし、そのまま冷却させます。その後、両端を引っ張ってガラスを折り曲げます。これにより、テーパー状のガラス管が2本作成されます。それぞれの細い部分は長さ約5 cmで、先端の直径は約0.5 mmになります。ピペット装置を準備するため、プラスチック製ピペットチップをマウスピースとして反対側の端に取り付け、ガラスピペットの鈍端をチューブに挿入します。マウスピペットを用いて胸腺葉を一つずつ慎重に回収し、0.8 µmフィルターの表面に配置します。器官培養では、フィルター1枚あたり5〜6個の胸腺葉を配置し、1つのディッシュにつき合計10〜12個の胸腺葉を置くことを推奨します。これにより、器官培養物が十分に成長するためのスペースが確保され、2つのジオキサジンによってすべての内因性リンパ球を除去することが可能になります。培養の準備が整ったら、10 cmペトリ皿の蓋をプラットフォームとして使用し、プラットフォームの直下に2回蒸留水を満たしてサンドイッチボックスの蓋を組み立てます。最大3つの皿をボックスに入れ、蓋をテープで密閉します。蓋の対角線上の2か所に、5 mmの空気孔をあけておきます。ボックスを37 °C、10% CO2のインキュベーターに5〜7日間静置した後、これらの培養物を分散させ、再び凝集させることで、制御された3次元環境における胸腺間質部位の相互作用を解析します。通常5〜7日間の培養期間後、フィルターを培地に浸し、ピンセットで葉をそっと押し出すことで、胸腺を回収します。リンパ球を含む胸腺は、非-dexamethasone処理のリンパ球葉と比較して、通常、小型で嚢胞状であることがわかります。これまで、胎児胸腺器官培養のセットアップ方法について説明しました。本プロトコルでは、胎児胸腺器官培養に2,3-ジアザインを処理する方法を示しました。これにより、通常5〜7日間の胸腺培養後にすべてのリンパ球系細胞が除去されます。これらの器官培養を用いて、再凝集器官培養を作製します。しかし、これが唯一の手法ではありません。私たちはまた、ジオキサジン処理を施していない胎児胸腺臓器培養物を、胸腺マウスの腎被膜下に移植して利用しています。さらに、in vivoで起こりうる二次的な影響を排除した制御可能なin vitro条件下でT細胞の発達を研究するために、リンパ球系胎児胸腺臓器培養物も使用しています。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは胸腺の文化を再集合させる2 -...

胸腺文化を再集合させる

我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で"ニッチ"の同定に役立つはずです。...

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

このビデオでは、iPS細胞由来の未熟T細胞から、三次元胸腺培養システムを用いて機能的な抗原特異的T細胞を作製するプロトコールを実演しています。iPS細胞由来の未成熟T細胞を内因性リンパ球枯渇マウスの胎児胸腺葉と共培養した結果、T細胞の成熟に成功し、CD8αβ+ MHCクラスI+...

iPS細胞由来胸腺移民を作出する3次元胸腺培養システム

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。...

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。...

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

現在の2D培養システムはin vivoのシナリオを模倣していないため、in...

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

我々は、フローサイトメトリーと組み合わせて、T細胞の開発の正および負の選択をモデル化するために使用することができ、胸腺切片の調製を記載します。胸腺スライスはまた胸腺細胞遊走、局在のその場での分析のために適合され、そして免疫蛍光及び二光子顕微鏡検査を介してシグナル伝達することができます。...

調製及び器官胸腺スライス培養の応用

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

我々は、ヌードマウスの腎カプセルに2'-デオキシグアノシン処理E18.5胸腺を移植するための簡単かつ効率的な方法を提供する。この方法は、甲状腺上皮細胞機能とT細胞の成熟の両方の研究に付加されるべきである。...

ヌードマウスにおける2'-デオキシグアノシン処理マウス胚性胸腺の腎サブカプセル移植

ここでは、胸腺上皮細胞(TEC)の成熟と長期維持、およびin...

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

学ぶ胎児胸腺器官培養の準備と2-dGuo処理によるリンパ球除去法。マウス胚からの胸腺摘出、培養条件の設定、T細胞発生のin vitro研究への応用を解説。免疫学研究に有用な技術です。

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

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