Name: 周産期虚血低酸素虚血性脳症モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶ新生児虚血低酸素性脳症モデル。生後7日のラットで左総頸動脈結紮後、37度の低酸素チャンバーで100分間処理し、TTC染色で梗塞領域を可視化する手法を解説。脳損傷メカニズム研究と治療法開発に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

アメリカ心臓協会とダイムの月によって資金を供給。

このプロトコルは、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所によってスタンフォード大学と遵守に動物実験用の委員会により承認された。 ラット新生HIEモデル<ol><li> 3から4誘導のための％とは1-2％、産後の日（PND）7のSprague - Dawleyの仔ラットは、（チャールズリバー研究所、（株）、ウィルミントン、MA）（Aerrane、バクスター、ディアフィールド、イリノイ州イソフルランで完全に麻酔するメンテナンス）。 </li><li>小切開は、左総頸動脈（CCA）を公開する（エクストラシンアイリスはさみ＃14088から10、ファイン科学ツール株式会社、フォスターシティ、カリフォルニア州）の首に行われます。 </li><li> CCAは、5から0絹縫合糸（5-0絹、エチコン、ゾマー、NJ）と連結する。 </li><li>切開は、シアノアクリレート系接着剤（エルマーズプロダクツ株式会社、コロンバス、オハイオ州）で閉じられます。切開は、テープで覆われていると麻酔が停止されます。子犬は、そのダムに戻り、1〜2時間のために静養に許可されています。 </li><li>子犬は、その後37℃で100分間、92％の窒素℃でバランス8％の酸素が含まれている低酸素室に置かれている8パーセントoxygen/92％の窒素ガス（Airgasの、サクラメント、カリフォルニア州）プラスチックカバーを装備したマウスのケージにチューブを経由して流れ。カバーがケージに合うように作られ、直径2cmの2つの穴を持っている、1つの8％の酸素ガスのタンクと別に接続されたチューブを受け取るためにそのうちにガスがflowoutすることができます。チャンバーは、水浴に配置され、使用前にウォームアップしていて、その内部に温度計は、低酸素の開始前に37℃を登録する必要があります。 </li><li>低酸素の100分の終わりに、子犬は​​回復のための彼らのダムに再び戻されます。 </li><li> 24時間低酸素状態の終了後、仔はイソフルランと深い麻酔により安楽死されています。脳組織は、生理食塩水、pH7.4（シグマケミカル共同、セントルイス、MO）リン酸緩衝の冷たい1パーセントTTCのソリューションに続く、冷生理食塩水で灌流される。 TTCは、光から保護しておく必要があります。 </li><li>脳を除去し、冷却した氷上で1〜2分、4つの冠状セクション離れて3ミリメートル（レベル1-4）のためにブレグマ1.8〜に対応する、opticchiasmと漏斗のレベルで吻方始め、カットされています〜2.0 mmのレベルを成体マウスの脳。 </li><li>脳スライスをTTC溶液に浸漬し、4％パラホルムアルデヒド/ PBSで一晩固定に続いて、8分間37℃でインキュベートする。 TTCは光に敏感なので、この時間の間に光からスライスを遠ざけること。 </li><li> TTC染色した切片はスキャンおよびデジタル化されています。使用してイメージJ（NIH、ベセスダ、MD）、以下はレベルごとに測定されています：梗塞の領域（未染色領域）、同側半球の面積、および対側半球の面積を。スライスごとのパーセント梗塞部位は次のように計算されます（同側半球の梗塞/地域の面積）または1、2、3、4。梗塞のパーセントの容積は、合計として計算される（A 1 + A 2 + A 3 + A 4）* 3ミリメートル。皮質や線条体損傷の領域も別々に同様の方法で定量することができる。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/old/955_2008_9_2_2/955_Fig-01.png" alt="図1" width="660" height="190" /> 図1。 TTCと代表的なHIE冠状レベル1-4で染色。 TTC染色した冠状セクションでは、梗塞の領域（白）を示しています。

<ol><li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+Hypoxic-Ischemic+Brain+Damage%3A+Evolution+of+an+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model.</a> Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).</li>
<li>Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+moderate+hypothermia+after+neonatal+hypoxia-ischemia%3A+short-+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome.</a> Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).</li>
<li>Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypothermia+and+hyperthermia+on+attentional+and+spatial+learning+deficits+following+neonatal+hypoxia-ischemic+insult+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats.</a> Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).</li>
<li>Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+post-hypoxic-ischemic+hypothermia+markedly+delays+neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+development%22%5BJournal%5D)">Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury.</a> Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).</li>
<li>Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+graded+hypothermia+on+hypoxic-ischemic+brain+damage%3A+a+neuropathologic+study+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).</li>
<li>Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).</li>
<li>Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+therapy+reduces+apoptosis+in+neonatal+hypoxia-ischemia+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model.</a> Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).</li>
<li>Grow, J., Barks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+hypoxic-ischemic+cerebral+injury+in+the+term+infant%3A+current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+perinatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts.</a> Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).</li>
<li>Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+brain+damage+after+hypoxic+ischemia+in+immature+adenosine+A2A+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).</li>
</ol>

げっ歯類生後HIEモデルでは、反復する脳低酸素症は新生児の周囲出生期間に発生したことが確立されたモデルです。大規模な組織学的および免疫組織化学的特性の研究は、7日齢齧歯類は妊娠後期ヒトの胎児7をモデル化するために類似した脳の成熟度を持っていることを実証している。げっ歯類のHIEモデルでは、低体温などの介入が3を検証している周囲の出生低酸素症2、から脳損傷のメカニズムを理解するにあたって非常に有益されています。このモデルは、最初にラットに完成し、最近ではマウスの8に適合させた。 言及を保証する特定の技術的な詳細があります。 <ol><li> CCAのライゲーションの前に、結合組織およびCCAを紛糾可能性迷走神経を必ず削除してください。 CCAの成功ライゲーションして、ライゲーション部位上記の容器の色が白くなります。また、それはまた、ライゲーションダブル二ライゲーション部位の途中で切断することをお勧めします。そのダムで子犬​​バックを配置する前にラベルをテープで連結されたCCA以上の切開をカバーしています。 </li><li>それぞれ子犬のための麻酔のない10分以上の最大持...

<table><tbody><tr><td>Sprague-Dawley ラット幼仔</td><td>動物</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>手術</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% Oxygen/ 92% Nitrogen Gas</td><td>手術</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

周産期虚血低酸素虚血性脳症モデル

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

低酸素性虚血性脳症（HIE）は、出生時に発生する全身性仮死の結果です。 HIEによる新生児の二五％は精神遅滞、脳性麻痺、てんかんを含め、厳しいと永続的な神経心理学的後遺症を開発する。 HIEの成果は、それが重要なHIEで新生児の脳損傷を軽減する治療戦略を特定し、開発すること、壊滅的と永続的です。そのために、低酸素性虚血性脳損傷のための新生児ラットモデルは、この人間の状態をモデル化するために開発されました。 HIEモデルは、最初バヌチら1によって検証され、以来広く周産期低酸素虚血2から生じる脳損傷のメカニズムを識別し、潜在的な治療介入の3,4をテストするために使用されています。 HIEモデルでは、2段階のプロセスであり、低酸素環境への曝露に続いて左総頸動脈の結紮を伴います。連結された頸動脈に同側半球の脳血流量（CBF）は、理由ウィリス動脈輪を介して側副血流量の減少しませんが低い酸素分圧で、同側半球のCBFは有意に減少し、一方的な虚血性傷害の結果。虚血脳組織を染色して識別するために、2,3,5 -塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）の使用は、元来はげっ歯類の脳虚血5の成人モデルのために開発され、最大72までの早期の時点で脳infarctinの程度を評価するために使用されます虚血性イベント6時間後。このビデオでは、我々は生後ラット脳における低酸素性虚血性損傷モデル、TTC染色を用いて梗塞サイズの評価を示しています。

低酸素性虚血性脳損傷のための出生後のラットのモデルは、ヒト新生児低酸素性虚血性脳症（HIE）の十分に確立されたモデルです。この記事では、出生後の仔ラットのHIEのモデルについて説明します。

新生児低酸素性虚血性脳症（HIE）は、出生時に生じる全身性アスフィキシアの結果として起こります。HIEを呈する新生児の25%に重度の...

この出生後低酸素性虚血性脳症モデルを誘導するため、生後7日目のSprague Dawleyラットの幼仔に微小外科手術を行い、左総頸動脈を結紮します。1〜2時間の回復時間を置いた後、幼仔を37 °Cに設定した低酸素チャンバー内に100分間入れます。その後、幼若動物を安楽死させるまで母動物に戻します。2回の全身灌流ステップの後、脳を取り出し、厚さ3 mmの切片に分切します。次に、梗塞部位を明らかにするため、1% 2, 3, 5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）溶液を用いて切片を染色します。こんにちは。スタンフォード大学医学部神経学・神経科学科、Andre研究室のHi tangoです。本日は、新生児低酸素虚血性脳損傷モデルの作製手順をご紹介します。当研究室では、新しい治療法の開発という最終目標に向けて、新生児脳における低酸素虚血性脳症のメカニズムを研究するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。まず、生後7日目のSprague Dawleyラットの幼仔を完全に麻酔します。イソフルランを使用し、導入には4%、維持には1〜2%を用います。数分後、足趾つまみテスト（toe pinch test）を行い、幼仔が麻酔状態にあることを確認します。次に、綿棒を用いて10%ポビドンヨード、続いて70%イソプロピルアルコールを塗布し、幼仔の頸部を滅菌します。その後、Fine Science Tools社製の滅菌済みの極細虹彩剪刀を用いて、正中線から左に約5 mmの位置に小さな切開を加え、鈍的剥離によって左総頸動脈（CCA）を露出させます。CCAを巻き込んでいる可能性がある結合組織と迷走神経を必ず除去してください。その後、Ethicon社製の5-0シルク縫合糸を用いてCCAを結紮します。結紮部位より上方の血管の色は、結紮直後に白く変化するはずです。結紮後、切開部をシアノアクリレート系接着剤で閉鎖し、テープで覆います。その後、麻酔を停止し、幼仔が意識を取り戻したことを確認してください。子マウスを温熱パッド付きのリカバリーボックスに入れます。必要に応じて、他の子マウスに対しても同様の手順を繰り返します。子マウスを親マウスに戻す前に、少なくとも5分間観察します。実験の1〜2時間前まで、仔マウスを安静にして回復させてください。8% oxygenと92% nitrogenでバランス調整された低酸素チャンバーを準備します。この準備として、直径2 cmの穴が2つ開いたプラスチックカバー付きのマウスケージを用意します。一方の穴に、8% oxygenと92% nitrogenを含む混合ガスタンクに接続されたチューブを挿入します。もう一方の穴はガスの流出用です。チャンバーをウォーターバスに入れ、チャンバー内に温度計を設置します。低酸素状態を開始する前に、温度計が37 °Cを示している必要があります。仔マウスが回復した後、低酸素チャンバーに入れ、37°Cで100分間保持します。低酸素状態の終了から24時間後に仔マウスを母マウスに戻し、イソフルランによる深い麻酔で安楽死させます。次に、冷やした生理食塩水を用いて左心室から心腔内灌流を行い、続いて冷やした1% TTC/PBS溶液で灌流します。TTCは光感受性があるため、遮光保存する必要があります。灌流ステップの後、頭部を氷上に1〜2分間置き、その後、氷で冷却したカミソリを用いて脳を露出させ、脳組織を4つのレベルでスライスします。スパチュラを用いて脳スライスを取り出し、TTC溶液に浸します。TTC染色を行うため、スライスを37 °Cのインキュベーターに8分間置きます。次に、切片をPBSで希釈した4%パラホルムアルデヒドに移し、切片を覆います。TTCは光に敏感であるため、切片を4 °Cで保存し、一晩固定させます。TTC染色した切片をスキャンしてデジタル化し、結果の解析に進みます。以下は、TTC染色を施した低酸素虚血性脳症の冠状断レベル1から4の代表的な結果です。Image Jを用いて、白く染色されていない領域を梗塞領域として示します。各レベルにおいて、梗塞面積Aおよび同側半球の面積Bを測定します。これらの測定値に基づき、1スライスあたりの梗塞面積の割合を、同側半球面積に対する梗塞面積の比（A1/B1、A2/B2、A3/B3、A4/B4）として算出します。次に、梗塞体積パーセントを、（1、2、3、および4の合計 × 3 mm）÷（B 1、2、3、および4の合計 × 3 mm）として算出します。皮質またはSAL損傷の領域についても、同様の方法で個別に定量化することが可能です。以上で、周産期虚血による低酸素性虚血性脳症モデルの作製方法について解説しました。本手順を行う際は、各CCA結紮における麻酔時間を10分以内に制限すること、低酸素チャンバー内に必ず温度計を設置すること、および温度を37 cent degreeに維持することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

the-hypoxic-ischemic-encephalopathy-model-of-perinatal-ischemia

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

大型動物モデルは、新生児仮死の生理学や薬理学の試験で良い並進値を持っています。生まれたばかりの子豚を使用して、我々は全身の血行動態および地域的、生化学的および病理学的経路と相関を持つ酸素の輸送を研究の利点を持っている新生児仮死をシミュレートするための実験プロトコルを開発しています。...

新生児仮死の新型モデル

このビデオは、新生児の低酸素虚血性脳損傷を研究するためのマウスモデルを作成する手順を示しています。これは、虚血を外科的に誘発し、動物を低酸素症にさらして脳の損傷を悪化させるための手順を概説しています。最後に、結果として生じる脳病変を評価し、マウスモデルがさらなる科学的研究のために準備されていることを確認する方法を示します。...

新生児低酸素性虚血性脳損傷のマウスモデルの確立

出典:Jantzie, L. L., et.alです。ラットの羊水内リポ多糖による出生前低酸素虚血を使用した未熟児の脳症のモデリング。J. Vis. Exp.

出生前ラットにおけるモデル脳症に対する低酸素性虚血性および炎症状態の誘発

周産期の窒息後の低酸素性虚血性脳症は、動物モデルを使用して研究することができます。新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデルを確立するために必要な手順を示します。...

新生児低酸素性虚血性脳症の子豚モデル

血栓塞栓性脳卒中モデルは、再開通療法を最適化するための重要なツールです。ここでは、一過性脳低酸素性虚血性(tHI)傷害に基づくマウス血栓性脳卒中モデルを報告します。これは、血栓症と梗塞を引き起こし、脳卒中患者と同様の治療ウィンドウで組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を介した線維素溶解に良好に反応します。...

一過性脳低酸素性虚血に基づく血栓性脳卒中モデル

未熟児の脳症は、早産による損傷に関連する中枢神経系の異常を包含します。...

ラットにおける羊膜内リポ多糖で出生前低酸素性虚血を使用した未熟児のモデル化脳症

新生児脳卒中は、早期の脳損傷の重要な原因であり、研究を可能にするためには、一貫した焦点損傷パターンと高い再現性を持つトランスレーショナルモデルが必要です。この研究では、完全正期相当のげっ歯類に非出血性の片側性限局性虚血再灌流障害を作成するための詳細な外科的手順について説明します。...

P10ラットにおける新生児脳卒中の一過性中大脳動脈閉塞モデル

生後に一側内頚動脈閉塞を行った 7 10 CD-1 マウス新生児低酸素性虚血性 (HI) モデルを作成する子犬とこんにちは脳損傷の効果を検討しました。非運営正常なマウスと比較してこれらのマウスの神経行動学的機能を検討した.

新生児低酸素性虚血性脳損傷のマウス モデルにおける神経行動学的評価

この方法は、P17フェレットにおける炎症感作性低酸素虚血性および高酸素性脳損傷を記述し、多くの後期乳児で経験した長期炎症と酸化脳損傷との間の複雑な相互作用をモデル化する。...

炎症感作後期低酸素虚血性脳損傷のフェレットモデル

本稿では、低酸素虚血を起こす新生児マウスにおける複数の深度電極を用いた連続的なビデオEEG記録の方法を説明する。...

新生児マウスにおける低酸素虚血期における連続映像脳波

学ぶ新生児虚血低酸素性脳症モデル。生後7日のラットで左総頸動脈結紮後、37度の低酸素チャンバーで100分間処理し、TTC染色で梗塞領域を可視化する手法を解説。脳損傷メカニズム研究と治療法開発に有用です。

周産期虚血低酸素虚血性脳症モデル

さらに動画を探す