Name: チックの全マウントの抗体染色のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶ チック胚の全マウント免疫組織化学法。パラホルムアルデヒド固定、HRP標識二次抗体、DAB基質を用いて抗原発現パターンを可視化し、ワックス包埋切片による断面解析も可能な発生生物学の有用技術です。

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（J.ドッド、TM JessellとA.川上）によって開発されたモノクローナル抗体は（15.3B9、PAX7）生物科学科、アイオワ大学でNICHDと維持の後援の下に開発された発達研究ハイブリドーマバンクから入手した、アイオワ州。 DPは、薬物乱用の国民の協会からルースキルシュシュタイン賞1F32 DA021977 - 01A1の受信者です。この作品は、RHFへマーガレットM. Alkek財団によってサポートされていました。

I.の概要図： このビデオでは、ニワトリ胚での全体のマウント免疫組織化学での別の手順を示しています。最初に、胚はPFAで固定されています[IHC1]。次に、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチされる[IHC2]。胚は、その後一次抗体[IHC3]でインキュベートする。数回の洗浄後、胚を二次抗体で[IHC4]をインキュベートされ、色の反応は、DAB [IHC5]と抗体染色を用いて明らかにされるオレンジ色の[IHC6]が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure 1.png" alt="図1" width="600" height="573" />パート1：胚を修正<ol><li>ニワトリ胚での全体のマウント免疫組織化学を実行するには、最初にピンセットで殻をタップし、シェルの部分を削除して、卵を開きます。 </li><li>鉗子と厚いアルブミンを削除して、胚が上向きに向くように粗い鉗子で卵黄嚢を傾けます。 </li><li>細かいハサミを使用して、胚の周りに卵黄嚢の正方形をカット。スプーンで卵黄から胚を取り出し、そしてPBSを含む皿の場所。 </li><li>解剖顕微鏡下で、慎重に膜と卵黄およびPBSを含む新鮮な皿に胚移植を削除します。 </li><li>鉗子や昆虫ピンで胚を突き止める、およびPBSを吸引除去する。 PBS中4％PFAでこれを交換し、胚は、室温で1時間を修正することができます。 </li></ol>パート2：抗体のステップの準備胚<ol><li>潜在的な微生物の汚染を最小限に抑えるために、すべて以下の手順でのddH 2 Oを使用してください。 </li><li>胚を固定された後、固定液を吸引除去し、化学廃棄物として適切に処分する。 PBSで皿を埋める。 </li><li>次に、顕微解剖ナイフを用いて、胚体外膜を除去するために胚の周りの角をカット。ピンセットで虫ピンを取り外します。 </li><li>ピンが削除された後、PBT（PBS pH7.4の、0.5％トリトンX）とを含むシンチレーションバイアルへ胚を転送するために平滑末端パスツールピペットを使用してください。 </li><li> 、PBTで10分間ずつ3回の胚を洗浄してください。 </li><li>シンチレーションバイアルからPBTを削除し、PBTxは潜在的な内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために0.3％H 2 O 2を含むと交換してください。 </li><li> nutator上で室温で2時間インキュベートする。 </li><li>その後、PBT、10分ごとに3回、30分ごとに3回で胚を洗浄してください。 </li></ol>パート3：抗体のインキュベーション<ol><li>抗体で胚を染色するために、ブロッキング緩衝液または1％BSA / 1％NGS / PBT（二次抗体がヤギで飼育されているため、我々はNGSを使用）で1時間胚を洗浄することにより開始します。 RTで1時間nutatorでインキュベートする。 </li><li> 4℃で2日間nutator上でCは、この溶液中でブロッキング緩衝液、及びインキュベート胚で一次抗体1:1に希釈する。一次抗体の希釈率は、一次抗体の選択に依存する。ここで、我々は、上澄みとして提供されている発達研究ハイブリドーマバンクからの抗体を使用してください。我々は、ブロッキング緩衝液で1:1に希釈する。 </li><li>次に、PBTで3 1時間の洗浄に続いてPBT 3位10分間の洗浄を、実行してください。 </li><li>洗浄後、ブロッキング緩衝液で二次抗体を1:2500に希釈する（この場合ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgG（H + L）、そしてこの溶液中でインキュベート胚の4でO / N ° nutatorでC。 </li><li> PBTの3 1時間の洗浄に続いてPBT 3位10分間の洗浄を、実行します。 </li></ol>パート3：色反応<ol><li>ステンド胚の呈色反応を開発するには、まずトリス緩衝液（100mMのトリスHCl、pH7.4）中2 20分間の洗浄を行います。 </li><li>一方、ヒュームフードの下で500μg/mlのトリス緩衝液中で（3,3&#39; - ジアミノベンジジン四塩酸塩）DAB基質を溶解し、氷の上に、暗闇の中で解決策を保つ。 </li><li>バイアルを含む胚から最後のTrisバッファー洗浄を削除し、ステップ3.2から5ミリリットルDAB溶液を交換してください。約20分のためのnutatorで暗所に保管してください。 DABを除染するために10％漂白剤溶液の入ったバケツにエッペンドルフ先端処分する。 </li><li>一方、0.3％の株式氷上のdH 2 O中のH 2 O 2を準備。 </li><li> DABで胚を含むバイアルに50μlのストックH 2 O 2を追加。暗所で保管してください。 1〜2分後、顕微鏡下で反応を監視する。 </li></ol>パート4：写真撮影​​および組織学のための胚の処理<ol><li>呈色反応が完了すると、漂白剤をバケツにDAB処分する。 5 mlの水道水に交換してください。 </li><li> PBSで2 10分間の洗浄を行います。 </li><li>写真とワックスのセクショニングのために処理するには、10分ごとに（25％、50％、75％、100％）エタノール系列で脱水。 </li><li> 0.5でエタノールを交換してください - 1ミリリットルシダーウッドオイルを（これは、胚を半透明になります）。杉の木の油で写真撮影のためのプロセス。 </li><li>以下の写真は、バイアルに胚を戻すと、100％エタノールで杉の木のオイルを交換してください。エタノールの手順を繰り返します。 </li><li>メールを交換してください100％エタノールに5％ファストグリーンFCFとthanol、と（このステップは、組織学のための胚を閲覧できるようになります）3分間インキュベートする。組織学のための100％エタノールとプロセスとファストグリーンFCFのソリューションを交換してください。 </li></ol>代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="図2" width="600" height="498" />以下に示す例では、胚が段階HH​​ 10（）、12（B）と11（C）で解剖され、胚は、新興神経crestasにPAX 7の発現を見せるだけでなく、体節と神経管（A、B）の; （C）においては、脊索は15.3B9（はA - 1）（発達研究ハイブリドーマバンクから提供された抗体）で標識されている。

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

このビデオでは、若いニワトリ胚のホールマウントの抗体染色を行うことで様々なステップを示しています。このプロトコルは、本質的に空間的および時間的ひよこ2,3における新規抗体の特徴だけでなく、侮辱4次胚の奇形を決定するために、既知の抗原マーカーの使用のために使用されます。

<table><tbody><tr><td>卵</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>プレミアム・フェルタイル</td><td>受精後、HH4段階（16時間）</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5または同等のもの</td><td></td></tr><tr><td>Marsh自動インキュベーター</td><td>その他</td><td>リヨン</td><td>処方箋</td><td></td></tr><tr><td>曲鉗子 (1)</td><td>ツール</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット (2)</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>精密鋏</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td> プラスチック製ディッシュ</td><td>ツール</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>ゴム球</td><td>ツール</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>パストゥールキャピラリーピペット</td><td>ツール</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70950-12</td><td>炎で端を丸める</td></tr><tr><td>マイクロダイセクティングナイフ</td><td>ツール</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>固定後、胚を周囲の膜から切り離すために使用する。</td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマー硬化剤およびベース</td><td>試薬</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>硬化剤1部とベース9部を混合し、37℃で一晩静置する。</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>試薬</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>30% H₂O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>次世代シーケンシング</td><td>試薬</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>試薬</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>これらの抗体の作製に、研究者はマウスドナーを用いました。</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG (H+L) 抗体 </td><td>試薬</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド</td><td>試薬</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>-20℃で保存してください。使用前にボトルを室温に戻してください。</td></tr><tr><td>シダーウッドオイル</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーンFCF</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>minutenピン 直径0.2mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

チックの全マウントの抗体染色のための方法

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

ニワトリ胚は、初期胚発生の研究に貴重なツールです。その透明性、アクセス性と操作の容易さ、それを脳、神経管や体節の開発に抗体発現を研究するための理想的なツールとなっています。このビデオでは、HRP標識二次抗体を用いたホールマウントの抗体染色で別の手順を示し、まず、胚は卵から解剖し、パラホルムアルデヒドで固定されています。第二に、内因性ペルオキシダーゼの不活化であり、胚は、その後一次抗体にさらされています。数回の洗浄後、胚は、HRPにコンジュゲートした二次抗体とインキュベートされる。ペルオキシダーゼ活性は、ジアミノベンジジン基質との反応を用いて明らかにされる。最後に、胚を固定して、写真とセクショニングのために処理されます。蛍光抗体の使用に比べてこの方法の利点は、胚は、このような断面で抗原部位の調査を可能にする、ワックスのセクショニングのために処理できることです。このメソッドは当​​初、ジェーンドッドとトムJessellによって導入された<sup&gt; 1</sup&gt;。

このビデオでは、全体のマウント免疫組織化学、抗原の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚における可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、ジェーンドッドとトムJessellによって導入されました。

ニワトリ胚は、初期胚発生の研究における貴重なツールです。その透明性、アプローチの容易さ、および操作性の高さから、それは...

このビデオでは、HRP標識二次抗体を用いたニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学におけるさまざまなステップを実演します。まず、胚をパラホルムアルデヒドで固定します。その後、内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させます。その後、胚を一次抗体でインキュベートします。数回洗浄した後、HRPが結合した二次抗体で胚をインキュベートし、DAB基質を用いて呈色反応させると、抗体染色はオレンジ色に現れます。蛍光抗体を使用する場合と比較して本手法の利点は、胚をパラフィン切片作成用に処理できるため、抗原部位を横断面で観察できることです。こんにちは。テキサスA&amp;M大学ヒューストン校、環境・ゲノム医学センターFIN研究室のデルフィンです。本日は、HRP標識抗体を用いて、ヒヨコ胚でホルモンマウント抗体染色の手順を実演します。当研究室では、抗てんかん薬投与後の胚の形態を研究するためにこの手法を用いています。それでは、ニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学染色の手順を開始しましょう。まず、ピンセットで殻を叩いて破片を取り除き、卵を開けます。ピンセットで濃厚アルブミンを除去し、粗いピンセットで卵黄嚢を傾けて、胚が上を向くようにします。次に、微細鋏を用いて胚周囲の卵黄嚢を正方形に切り出します。スプーンで卵黄から胚を取り出し、解剖顕微鏡下でPBSを入れたディッシュに置きます。卵黄内の膜を慎重に取り除き、胚をPBSを入れた新しいディッシュに移します。胚を移した後、ピンセットと昆虫針で胚を固定し、PBSを吸引します。これをPBSで希釈した4% PFAに置換し、潜在的な微生物汚染を最小限に抑えるため、室温で1時間固定します。胚の固定後、以降のすべての手順では脱イオン水（H2O）を使用してください。固定液を吸引し、化学廃棄物として適切に廃棄します。ディッシュにBSを満たします。次に、マイクロダイセクションナイフを用いて、胚の周囲を四角く切り取り、余分な胚外膜を除去します。ピンを抜いた後、ピンセットで昆虫ピンを取り除きます。鈍端のパスツールピペットを使用して、胚をPBT containingが入ったシンチレーションバイアルに移します。胚をPBTで10分間ずつ3回洗浄します。シンチレーションバイアルからPBTを除去し、潜在的な内因性ペルオキシダーゼを不活化させるために0.3%H 2 0 2を含むPBTXに交換します。室温のミューテーター（振盪機）上で2時間インキュベートします。まず胚をPBTで10分間ずつ3回洗浄し、次に30分間ずつ3回洗浄します。抗体で胚を染色するため、まずブロッキング緩衝液または1%BSA 1%NGSで1時間、胚を洗浄します。二次抗体がヤギで作成されているため、NGSを使用します。ブロッキングバッファーで一次抗体を1:1に希釈し、胚をこの溶液中で4°Cで2日間インキュベートします。その後、室温で1時間、ムタター（mutator）上でインキュベートします。一次抗体の希釈倍率は、使用する一次抗体によって異なります。ここでは、上清として提供されているdevelopmental studies hybrid DOMAバンクの抗体を使用します。これをブロッキングバッファーで1:1に希釈します。次に、PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の洗浄を3回行います。洗浄後、二次抗体をブロッキングバッファーで1:2,500に希釈します。ここではペルオキシダーゼ標識ヤギ抗US IgGを用い、胚をこの溶液中で4°Cのシェーカーを用いて一晩インキュベートします。染色した胚の色反応を発現させるため、PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の手洗いを3回行います。最初に、100 millimolar tris、HCL pH 7.4のTrisバッファーで20分間の洗浄を2回行います。次に、胚の入ったバイアルから最後のTSバッファー洗浄液を取り除き、5 millilitersのDAB溶液に置き換えます。ミューテーター内で20分間暗所で静置します。マイナーチップは10%漂白剤溶液の入ったバケツに廃棄してください。DABを滅菌するために、16 µL添加します。胚を含むDAB入りのバイアルにH₂O₂ストック溶液を加えます。遮光して保管してください。10分後、顕微鏡下で反応を観察し、呈色反応が完了したことを確認します。DABは漂白剤の入ったバケツに廃棄し、5 mLの新しい溶液と交換してください。水道水で洗浄します。次に、写真撮影およびパラフィン切片作成の準備として、PBSで10分間の洗浄を2回行います。染色した胚を、25%、50%、75%、100%のエタノール系列でそれぞれ10分間脱水します。脱水後、エタノールを0.5〜1 mLのシダーウッドオイルに交換します。これにより、胚が半透明になり、シダーウッドオイル中での撮影が可能になります。撮影後、胚をバイアルに戻し、シダーウッドオイルを100% ethanolに交換します。最後に、エタノールを100%エタノールで希釈した5%fast green FCFに置換し、3分間インキュベートします。この工程により、組織学的解析のために胚を可視化させます。fast green FCF溶液を100%エタノールに置換し、組織学的処理を行います。染色された胚の3つの例を以下に示します。これらのステージ11の胚は、Jane DodとTom Gesselの研究室で開発された、結節索特異的抗体である15.3 Bを用いてラベル化されているか、あるいはラベル化されていません。DABに2分間浸漬させた後でも、胚はまだ透明なままです。DABに20分間浸漬させると、結節索にわずかな標識が現れます。最終的に40分後には、結節索の標識が完了します。この例では、Tom Jesselの研究室で開発された抗体であるPAC sevenが、神経管閉鎖の初期段階および中脳から出現する頭部神経堤細胞をどのように認識するかを示します。ここでは、David Wilkinsonの研究室のCroc 20プローブで胚を標識し、続いて抗体を用いて標識しています。これで、 chick胚におけるホールマウント免疫組織化学染色の方法について説明しました。この手順は、事前にホールマウントin situハイブリダイゼーション処理を施した胚に対しても適用可能です。その場合は、in situハイブリダイゼーション後、胚を1時間短時間固定し、続いて抗体染色を行ってください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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