チックの全マウントの抗体染色のための方法
February 2nd, 2009
このビデオでは、全体のマウント免疫組織化学、抗原の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚における可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当初、ジェーンドッドとトムJessellによって導入されました。
このビデオでは、HRP標識二次抗体を用いたニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学のさまざまなステップを示しています。まず、胚をパラホルムアルデヒドに固定します。その後、内因性ペルオキシダーゼ活性が消光されます。
その後、胚を一次抗体でインキュベートします。数回の洗浄後、胚を二次抗体にインキュベートし、HRPに結合した色反応がDAB基質を用いて明らかになり、抗体染色はオレンジ色に見える。蛍光抗体を使用する場合よりもこの方法の利点は、胚をワックス切片化のために処理できるため、断面の抗原部位の研究が可能になることです。
こんにちは、私はヒューストンのテキサスaとmにあるCenter for Environmental and Genomic MedicineのFIN研究室のDelphineです。本日は、HRP標識抗体を用いて頬胚のホルモンマウント抗体を染色する手順をご紹介します。私たちは、抗てんかん薬による治療後の胚の形態を研究するために、実験室でこの手順を使用します。
それでは、始めましょう ニワトリの胚に全マウント免疫組織化学を実行するために。まず、鉗子で殻を叩き、殻の破片を取り除いて卵を開きます。鉗子で濃厚なアルブミンを取り除き、粗い鉗子で卵黄袋を傾けて、胚が上を向くようにします。
次に、細いハサミを融合して、胚の周りに四角い卵黄袋を切ります。スプーンで卵黄から胚を取り出し、PBSの入った皿に解剖顕微鏡で入れます。卵黄の膜を慎重に取り除き、PBSを含む新鮮な皿に胚を移します。
胚を移植した後、鉗子と昆虫ピンで胚を固定し、PBSを吸引します。これをPBS中の4%PFAに置き換え、胚を室温で1時間固定して、潜在的な微生物汚染を最小限に抑えます。胚が固定された後、以下のすべてのステップで固定液を吸引し、化学廃棄物として適切に処理する場合は、D脱イオンH2Oを使用してください。
皿にBSを入れます。次に、マイクロダイセクションナイフを使用して、胚の周りに正方形を切り取り、余分な胚膜を取り除きます。ピンを取り外した後、鉗子で昆虫ピンを取り外します。鈍い端の牧草地ピペットを使用して、PBTを含むシンチレーションバイアルに胚を移します。
胚をPBTで3回、それぞれ10分間洗浄します。シンチレーションバイアルからPBTを取り出し、0.3%H 2 0 2を含むPBTXに置き換えて、潜在的な内因性ペルオキシダーゼを不活性化します。ミューテーター上で室温で2時間インキュベートします。
胚をPBTで最初に3回、それぞれ10分間、次に3回、それぞれ30分間洗浄します。胚を抗体で染色する。まず、胚をブロッキングバッファーまたは1%BSA、1%NGSで1時間洗浄します。
二次抗体はヤギで育てられるため、NGSを使用しています。インキュベーション後、ミューテーター上で室温で1時間インキュベートし、一次抗体をブロッキングバッファーで1対1に希釈し、この溶液で胚を4°Cで2日間インキュベートします。ミューテーター上。
一次抗体の希釈係数は、一次抗体の選択によって異なります。ここでは、スーパーナチンとして提供されているDevelopmental Studies Hybrid DOMAバンクの抗体を使用します。ブロッキングバッファーで1対1に希釈します。
次に、PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の洗浄を3回行います。洗浄後、二次抗体をブロッキングバッファーで1:2, 500に希釈します。この場合、ペルオキシダーゼはヤギの抗US IgGを結合させ、この溶液で胚をミューテーター上で摂氏4度で一晩インキュベートします。
PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の洗浄を3回行い、染色した胚の色反応を進行させます。最初の 2 回、トリス緩衝液 100 ミリモルトリス、HCL pH 7.4 で 20 分間洗浄します。次に、胚を含むバイアルから最後のTSバッファー洗浄液を取り出し、5ミリリットルのDAB溶液と交換します。
ミューテーターの上で20分間暗闇に置いてください。アイノアチップは、10%漂白剤溶液が入ったバケツに捨ててください。DABを除染するために、16マイクロリットルを追加します。
DAB中の胚を含むバイアルへのストックH 2 0 2。暗所に保管してください10分後、色反応が完了したら顕微鏡で反応を監視します。DABは漂白剤バケツに廃棄し、5ミリリットルと交換します。
水道水。次に、PBSで10分間の洗浄を2回行い、写真撮影とワックス切片の処理を行います。染色した胚をエタノール系列で25%50%75%および100%それぞれ10分間脱水します。
脱水後、エタノールを0.5〜1ミリリットルのシダーウッドオイルと交換します。これにより、胚はシダーウッドオイルでの写真撮影のための半透明のプロセスになります。撮影後、胚をバイアルに戻し、シダーウッドオイルを100%エタノールと交換します。
最後に、エタノールを100%エタノール中の5%fastグリーンFCFに交換し、3分間インキュベートします。このステップにより、胚が組織学のために見えるようになります。高速グリーンFCF溶液を100%エタノールと組織学のプロセスに交換します。
ここでは、染色された胚の3つの例を紹介します。これらのステージ11の胚は、15.3、B、9とラベル付けされているかどうかです。1つは、Jane dodとTom Gesselの研究室で開発されたリンパ節索特異的抗体です。
DABで2分後、胚はまだ透明です。DABで20分後、リンパ節コードにわずかな標識が現れます。最後に、40分後、結節コードのラベリングが完了します。
この例では、Tom Jesselの研究室で開発された抗体であるPAC sevenが、神経管閉鎖の初期段階と中脳から出現する脳神経堤細胞をどのように認識するかを示します。ここでは、胚はDavid Wilkinsonの研究室からのCroc 20プローブで標識されていますが、その後に抗体は1つもありませんでした。ホールマウント免疫組織化学のアンチェック胚の方法をお見せしました。
この手順は、以前に全マウントin situハイブリダイゼーションのために処理された胚にも使用できます。この場合、in-situハイブリダイゼーション後1時間胚を短時間固定した後、抗体染色を進めます。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
このビデオは、若いひよこの胚における抗原の空間的および時間的発現パターンを視覚化するために使用される技術である全実装免疫組織化学を実演しています。この方法には、固定や抗体インキュベーションなどのいくつかのステップが含まれ、染色結果を明らかにします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 免疫組織化学
背景
- 全実装免疫組織化学は胚における抗原分布の研究を可能にします。
- この技術はJane DoddとTom Jessellによって最初に導入されました。
- 発生プロセスと遺伝子発現に関する洞察を提供します。
- HRP結合二次抗体は抗原の視覚化を向上させます。
研究の目的
- 全実装免疫組織化学の手順を実演すること。
- ひよこの胚における抗原発現を視覚化すること。
- この方法を蛍光抗体技術と比較すること。
使用された方法
- パラホルムアルデヒドによる胚の固定。
- 内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチング。
- 一次および二次抗体でのインキュベーション。
- 抗体染色の視覚化にDAB基質を使用した色反応の明らか化。
主な結果
- 抗体染色はオレンジ色に見え、抗原検出の成功を示しています。
- 染色後、胚はワックス切片に処理できます。
- この方法により抗原部位の断面研究が可能になります。
- HRP結合抗体の染色効果を実証しています。
結論
- 全実装免疫組織化学はひよこの胚を研究するための貴重な技術です。
- 抗原発現パターンの明確な視覚化を提供します。
- この方法はその後の歴史学的分析に有利です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Whole mount immunohistochemistry in chick embryos enables spatial mapping of antigen expression, supporting target validation in developmental neuroscience. The method provides mechanistic de-risking by linking molecular targets to phenotypic outcomes in a disease-relevant system. Compatibility with wax sectioning allows cross-functional teams to correlate immunohistochemical data with histological analysis, improving translational continuity in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing antigen distribution in developing neural tube and somite.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of target engagement in intact embryos.
- Predictive Value: Enhances target confidence by providing spatially resolved expression data for lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible staining patterns using HRP-conjugated secondary antibodies and DAB substrate.
- Quantitative Output: Enables semi-quantitative assessment of antigen sites via color intensity, supporting assay optimization.
- Platform Reuse: Compatible with wax sectioning, allowing the same stained sample to serve multiple downstream analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying embryotoxic effects of compounds, such as antiepileptic drugs, in a vertebrate model.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent antigen tracking across whole mount and sectioned formats.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes correlate with target modulation in developing tissues.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target validation and assay development stages before lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by revealing spatiotemporal antigen expression in developing brain and neural tube.
- Screening: Delivers standardized immunohistochemical readouts that support reproducible compound evaluation in embryonic systems.
- Analytics: Produces chromogenic signal detectable via brightfield microscopy, enabling quantitative image analysis for condition comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by allowing antigen localization to be validated in both whole mount and histological sections.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable histology-capable platform applicable across multiple projects studying developmental toxicity or target expression.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking antigen presence to specific embryonic structures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, blocking, and antibody incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing histological confirmation of target modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on developmental target engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo dissection, immunohistochemistry, and chromogenic detection.
- Dependent on access to microscopes, mutators, and ventilation for DAB and H2O2 handling.
- Necessitates standardization of antibody dilution and washing protocols across teams.
- Adaptation to other species may require optimization of permeability and blocking steps.
- Practical limitations include longer incubation times and need for careful DAB disposal to prevent artifact.
