チックの全マウントの抗体染色のための方法

このビデオでは、HRP標識二次抗体を用いたニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学におけるさまざまなステップを実演します。まず、胚をパラホルムアルデヒドで固定します。その後、内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させます。

その後、胚を一次抗体でインキュベートします。数回洗浄した後、HRPが結合した二次抗体で胚をインキュベートし、DAB基質を用いて呈色反応させると、抗体染色はオレンジ色に現れます。蛍光抗体を使用する場合と比較して本手法の利点は、胚をパラフィン切片作成用に処理できるため、抗原部位を横断面で観察できることです。

こんにちは。テキサスA&M大学ヒューストン校、環境・ゲノム医学センターFIN研究室のデルフィンです。本日は、HRP標識抗体を用いて、ヒヨコ胚でホルモンマウント抗体染色の手順を実演します。当研究室では、抗てんかん薬投与後の胚の形態を研究するためにこの手法を用いています。

それでは、ニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学染色の手順を開始しましょう。まず、ピンセットで殻を叩いて破片を取り除き、卵を開けます。ピンセットで濃厚アルブミンを除去し、粗いピンセットで卵黄嚢を傾けて、胚が上を向くようにします。

次に、微細鋏を用いて胚周囲の卵黄嚢を正方形に切り出します。スプーンで卵黄から胚を取り出し、解剖顕微鏡下でPBSを入れたディッシュに置きます。卵黄内の膜を慎重に取り除き、胚をPBSを入れた新しいディッシュに移します。

胚を移した後、ピンセットと昆虫針で胚を固定し、PBSを吸引します。これをPBSで希釈した4% PFAに置換し、潜在的な微生物汚染を最小限に抑えるため、室温で1時間固定します。胚の固定後、以降のすべての手順では脱イオン水（H2O）を使用してください。固定液を吸引し、化学廃棄物として適切に廃棄します。

ディッシュにBSを満たします。次に、マイクロダイセクションナイフを用いて、胚の周囲を四角く切り取り、余分な胚外膜を除去します。ピンを抜いた後、ピンセットで昆虫ピンを取り除きます。鈍端のパスツールピペットを使用して、胚をPBT containingが入ったシンチレーションバイアルに移します。

胚をPBTで10分間ずつ3回洗浄します。シンチレーションバイアルからPBTを除去し、潜在的な内因性ペルオキシダーゼを不活化させるために0.3%H 2 0 2を含むPBTXに交換します。室温のミューテーター（振盪機）上で2時間インキュベートします。

まず胚をPBTで10分間ずつ3回洗浄し、次に30分間ずつ3回洗浄します。抗体で胚を染色するため、まずブロッキング緩衝液または1%BSA 1%NGSで1時間、胚を洗浄します。

二次抗体がヤギで作成されているため、NGSを使用します。ブロッキングバッファーで一次抗体を1:1に希釈し、胚をこの溶液中で4°Cで2日間インキュベートします。その後、室温で1時間、ムタター（mutator）上でインキュベートします。

一次抗体の希釈倍率は、使用する一次抗体によって異なります。ここでは、上清として提供されているdevelopmental studies hybrid DOMAバンクの抗体を使用します。これをブロッキングバッファーで1:1に希釈します。

次に、PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の洗浄を3回行います。洗浄後、二次抗体をブロッキングバッファーで1:2,500に希釈します。ここではペルオキシダーゼ標識ヤギ抗US IgGを用い、胚をこの溶液中で4°Cのシェーカーを用いて一晩インキュベートします。

染色した胚の色反応を発現させるため、PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の手洗いを3回行います。最初に、100 millimolar tris、HCL pH 7.4のTrisバッファーで20分間の洗浄を2回行います。次に、胚の入ったバイアルから最後のTSバッファー洗浄液を取り除き、5 millilitersのDAB溶液に置き換えます。

ミューテーター内で20分間暗所で静置します。マイナーチップは10%漂白剤溶液の入ったバケツに廃棄してください。DABを滅菌するために、16 µL添加します。

胚を含むDAB入りのバイアルにH₂O₂ストック溶液を加えます。遮光して保管してください。10分後、顕微鏡下で反応を観察し、呈色反応が完了したことを確認します。DABは漂白剤の入ったバケツに廃棄し、5 mLの新しい溶液と交換してください。

水道水で洗浄します。次に、写真撮影およびパラフィン切片作成の準備として、PBSで10分間の洗浄を2回行います。染色した胚を、25%、50%、75%、100%のエタノール系列でそれぞれ10分間脱水します。

脱水後、エタノールを0.5〜1 mLのシダーウッドオイルに交換します。これにより、胚が半透明になり、シダーウッドオイル中での撮影が可能になります。撮影後、胚をバイアルに戻し、シダーウッドオイルを100% ethanolに交換します。

最後に、エタノールを100%エタノールで希釈した5%fast green FCFに置換し、3分間インキュベートします。この工程により、組織学的解析のために胚を可視化させます。fast green FCF溶液を100%エタノールに置換し、組織学的処理を行います。

染色された胚の3つの例を以下に示します。これらのステージ11の胚は、Jane DodとTom Gesselの研究室で開発された、結節索特異的抗体である15.3 Bを用いてラベル化されているか、あるいはラベル化されていません。

DABに2分間浸漬させた後でも、胚はまだ透明なままです。DABに20分間浸漬させると、結節索にわずかな標識が現れます。最終的に40分後には、結節索の標識が完了します。

この例では、Tom Jesselの研究室で開発された抗体であるPAC sevenが、神経管閉鎖の初期段階および中脳から出現する頭部神経堤細胞をどのように認識するかを示します。ここでは、David Wilkinsonの研究室のCroc 20プローブで胚を標識し、続いて抗体を用いて標識しています。これで、 chick胚におけるホールマウント免疫組織化学染色の方法について説明しました。

この手順は、事前にホールマウントin situハイブリダイゼーション処理を施した胚に対しても適用可能です。その場合は、in situハイブリダイゼーション後、胚を1時間短時間固定し、続いて抗体染色を行ってください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。