チックの全マウントの抗体染色のための方法

このビデオでは、HRP標識二次抗体を用いたニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学染色の各ステップを実演します。まず、胚をパラホルムアルデヒドで固定します。その後、内因性ペルオキシダーゼ活性を消去します。

その後、胚を一次抗体でインキュベートします。数回の洗浄の後、胚をHRP結合二次抗体でインキュベートします。DAB基質を用いて呈色反応させると、抗体染色部位がオレンジ色に現れます。蛍光抗体を用いる方法と比較して本手法の利点は、胚をパラフィン包埋して切片作成できるため、抗原部位を横断切片で観察できる点にあります。

こんにちは。ヒューストンのテキサスA&M大学、環境・ゲノム医学センターのFIN研究室のデルフィーヌです。本日は、HRP標識抗体を用いたヒヨ embryo のホルモンマウント抗体染色の手順をご紹介します。当研究室では、抗てんかん薬投与後の胚の形態を研究するためにこの手法を用いています。

それでは、ニワトリ胚のホールマウント免疫組織化学染色を開始します。まず、ピンセットで殻を叩いて破砕し、殻を取り除いて卵を開封します。ピンセットで厚い白卵膜を取り除き、粗いピンセットで卵黄嚢を傾け、胚が上を向くようにします。

次に、精巧な剪刀を用いて、胚の周囲の卵黄嚢を正方形に切り出します。スプーンで胚を卵黄から取り出し、解剖顕微鏡下でPBSを含むディッシュに置きます。卵黄にある膜を慎重に除去し、胚をPBSを含む新しいディッシュに移します。

胚を移した後、ピンセットと昆虫ピンで胚を固定し、PBSを吸引します。これをPBSで調製した4% PFAに置き換え、室温で1時間固定して、潜在的な微生物汚染を最小限に抑えます。胚の固定後、以下のすべてのステップでは脱イオン水を使用してください。固定液を吸引し、化学廃棄物として適切に廃棄します。

ディッシュにBSを満たします。次に、マイクロダイセクションナイフを用いて、胚の周囲を四角く切り取り、余分な胚外膜を除去します。ピンを抜いた後、ピンセットで昆虫ピンを取り除きます。先端が丸いパステールピペットを使用して、胚をPBTを含むシンチレーションバイアルに転移させます。

胚をPBTで10分間ずつ3回洗浄します。シンチレーションバイアルからPBTを取り除き、潜在的な内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために、0.3% H₂O₂を含むPBTXと置換します。ローター上で室温で2時間インキュベートします。

まず、胚をPBTで10分間ずつ3回洗浄し、次に30分間ずつ3回洗浄します。抗体で胚を染色するため、ブロッキングバッファーまたは1%BSA 1%NGS中で1時間、胚を洗浄することから始めます。

二次抗体がヤギで精製されているため、NGSを使用します。ブロッキングバッファーで一次抗体を1:1に希釈し、胚をこの溶液中で4 °Cで2日間インキュベートします。その後、ムテーター上で室温で1時間インキュベートします。

一次抗体の希釈倍率は、使用する一次抗体によって異なります。ここでは、上清として提供されるdevelopmental studies hybrid DOMAバンクの抗体を使用します。これをブロッキングバッファーで1:1に希釈します。

次に、PBTで10分間の洗浄を3回行い、続いてPBTで1時間の洗浄を3回行います。洗浄後、二次抗体をブロッキングバッファーで1:2,500に希釈します。ここではペルオキシダーゼ標識ヤギ抗US IgGを使用し、胚をこの溶液中で4°Cのシェーカーを用いて一晩インキュベートします。

染色した胚の呈色反応を進行させるため、PBTで10分間の洗浄を3回、続いてPBTで1時間の洗浄を3回行います。まず、100 millimolar tris, HCL pH 7.4のTris緩衝液で20分間の洗浄を2回行います。次に、胚の入ったバイアルから最後のTS緩衝液洗浄液を除去し、5 millilitersのDAB溶液に交換します。

変異原性物質を遮光し、20分間静置します。pipette tipは10%次亜塩素酸ナトリウム溶液の入ったバケツに廃棄してください。DABを不活化させるため、16 µL添加します。

DAB溶液中の胚が入ったバイアルにH₂O₂ストック溶液を加えます。暗所に保管してください。10分後、顕微鏡下で反応を観察し、呈色反応が完了したことを確認します。使用済みのDABは漂白剤の入ったバケツに廃棄し、5 mLの新しい溶液と交換してください。

水道水で洗浄します。次に、写真撮影およびパラフィン切片作製の準備として、PBSで10分間の洗浄を2回行います。染色した胚を、25%、50%、75%、100%のエタノール系列で、それぞれ10分間脱水します。

脱水後、エタノールを0.5〜1 mLのシダーウッドオイルに置換します。これにより、胚が半透明となり、シダーウッドオイル中での撮影が可能になります。撮影後、胚をバイアルに戻し、シダーウッドオイルを100%エタノールに置換します。

最後に、エタノールを5% fast green FCF（100%エタノール溶液）に置換し、3分間インキュベートします。この工程により、組織学的観察において胚が可視化されます。fast green FCF溶液を100%エタノールに置換し、組織学的処理を行います。

以下は染色された胚の3つの例です。これらのステージ11の胚は、Jane DodとTom Gesselの研究室で開発されたnodal cord特異的抗体である15.3 Bを用いて、標識されているものとされていないものがあります。

DABに2分間浸漬させた後でも、胚は依然として透明なままです。DABに20分間浸漬させると、結節索にわずかな標識が現れます。最終的に40分後には、結節索の標識が完了します。

この例では、Tom Jesselの研究室で開発された抗体であるPAC sevenが、神経管閉鎖の初期段階および中脳から出現する頭部神経堤細胞をどのように認識するかを示します。ここでは、胚をDavid Wilkinsonの研究室のCroc 20プローブでラベル付けし、続いて抗体を用いて染色しています。以上で、胚のホールマウント免疫組織化学染色の方法を説明しました。

この手順は、全マウントin situハイブリダイゼーション（whole mount in situ hybridization）をすでに行った胚に使用することも可能です。その場合は、in situハイブリダイゼーション後、胚を1時間短時間固定し、その後抗体染色に進んでください。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。