Name: 大槽マウスでの脳脊髄液のシリアル収集のためのテクニック (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ大槽マウスからの脳脊髄液シリアル採取法。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルでAβやタウの経時的変化を正確に測定し、疾患進行と治療効果評価に有用なバイオマーカー解析を可能にします。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちの活動は、NIHの助成金NS048447とAG017216to KDによってサポートされています。里六は、オリジナルのプロトコルの開発中に、彼の監督と支援のために博士ヘイッキTanilaを（クオピオ大学、クオピオ、フィンランド）に感謝いたします。

ガラスキャピラリーチューブを引っ張る <ol><li>ガラスキャピラリーチューブはサターインストゥルメント社（ホウケイ酸ガラス、B100 - 75 - 10）から購入しています。 </li><li> 300で設定された熱指数と330で設定された圧力の指数で、マイクロピペットプラー迸るサターP - 87キャピラリーチューブを引き出します。 </li><li>テーパー先端が約0.5 mmの内径を持つように、はさみでガラスキャピラリーチューブの先端を切り取ります。 </li></ol> CSFのための大槽穿刺法 CSF試料は、大槽（図1）1以前に発表されたメソッドを使用してから取得されます。 <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_2/960_Figure-01.png" alt="脳の解剖学的図:小脳、大槽、皮質、脳幹ラベル。" width="432" height="184" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図1"> 図1 1。マウスは、ケタミン（100mg/kg）とキシラジン（10mg/kgより少ない）、腹腔内投与によってanesthesizedされています。麻酔導入の時間の間に、マウスは37℃のインキュベーター内で保持されます。 2。首の皮膚を剃毛され、そしてマウスは、加温パッドの直接接触を持つ定位固定装置に発生しやすく配置されます。加熱パッドから発生する熱が体温の変化に応じて調整されるように直腸温度プローブを直腸に挿入されます。ヘッドは、ヘッドアダプタで固定されています。手術部位は7 0％エタノール（3回繰り返す） に続いて、10％ポビドンヨードでswabbedされ、そして皮膚の矢状切開は、後頭部に劣って行われます。 3。解剖顕微鏡下で、皮下組織や筋肉が（M.二腹のcervicisとmの頭直背大手 ）鉗子で鈍的切開で区切られています。 microretractorsのペアは離れて筋肉を保持するために使用されます。 4。マウスは頭部がボディとほぼ135 Oの角度を形成するように定められている。 5。解剖顕微鏡下で、大槽の硬膜は、延髄と主要な血管（動脈背棘）、およびCSF領域が（図2）表示するかを介して輝くと明確な逆三角形として表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_3/960_Figure-02.png" alt="外科的解剖学的デモンストレーション;解剖手順;組織への曝露;教育目的。" width="304" height="307" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図2"> 図2 6。硬膜は、滅菌綿棒で乾燥したブロットされています。背動脈の棘（図2）に横方向の硬膜を介してチテルナマグナにキャピラリーチューブを貫通する。キャピラリーチューブの挿入に抵抗の顕著な変化に続いて、CSFは、キャピラリー管に流れる。 7。慎重にキャピラリーチューブを取り外し、および1mm内径を持つポリエチレンチューブを介して3 mlシリンジに接続してください。事前にマーク0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにCSFを注入し、直ちにドライアイスでチューブを凍結し、-80℃の冷凍庫にそれを転送する。 8 CSFのサンプリングの後、筋肉が再整列されており、皮膚が（4-0、エチコン、ジョンソン＆ジョンソン）縫合されています。 0.9％塩化ナトリウムの約1mlは、デハイドレーションを防止するために皮下注射される。マウスは、それが回復するまで体温を維持するためにインキュベーターに保たれ、マウスの体重は1日、および手術後1週間を監視されます。 結果と考察 我々は、検出可能なプラズマ汚染することなくマウスからのCSFのシリアルサンプリングするための信頼性の高いプロトコルを説明。 1。全体の手順は、通常、マウスあたり10分（麻酔を含む）を取ります。 CSF得られたの体積は、マウス系統に依存しています。 P301L（JNPL3）マウス3が約10μL-15μlの収率を得たながら、我々は2を使用したPS / APPダブルTgマウスでは、平均的な量は、約5μL（3〜7μL）です。シリアルサンプリングの場合は、7-8μlの最大は、安全に2-3ヶ月の間隔でそれぞれの時間を撮影することができます。 2。手術中は、それは大槽の硬膜を十分に露出することができるように定位固定フレーム上で適切にマウスの頭と体を配置することが重要です。アポ4の免疫ブロットによりCSFのサンプルで監視できる血漿タンパク質、からの汚染を防ぐためにキャピラリチューブを硬膜を貫通するときに慎重に血管を避けてください。 3。組織の癒着は、以下のサンプリングのための素因出血によって難易度を増加させることができるように各手術時の組織損傷を最小限に抑えることは、重要です。 4。麻酔によって引き起こされる低体温が大幅に非常に急速に5を 、脳内のリン酸化タウのレベルに影響する可能性があるため、体温がうまく手術中に維持される必要があります。 5。抗体ELISAプロトコルと我々が使用した抗体は、Refoloらに詳細に記載された。6。 1:50-1:60に希釈したときにPS / APPマウスからの脳脊髄液の二液は、満足のいく結果が得られます。タウELISAの場合は、P301L（JNPL3）マウス4から5μlのCSFは十分です総タウの検出、またはタウ 蛍光体は、トレオニンでylated 231（キットはバイオソースから購入されています）。 6。この手法は、脳脊髄液の少量が必要なアッセイには十分となっている神経疾患、の他のマウスモデルに適用することができます。

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+Abeta42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).</li>
<li>Holcomb, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Alzheimer-type+phenotype+in+transgenic+mice+carrying+both+mutant+amyloid+precursor+protein+and+presenilin+1+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes.</a> Nat Med. 4, 97(1998).</li>
<li>Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrillary+tangles%2C+amyotrophy+and+progressive+motor+disturbance+in+mice+expressing+mutant+%28P301L%29+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein.</a> Nat Genet. 25, 402- (2000).</li>
<li>DeMattos, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque-associated+disruption+of+CSF+and+plasma+amyloid-beta+%28Abeta%29+equilibrium+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurochem. 81, 229(2002).</li>
<li>Planel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+leads+to+tau+hyperphosphorylation+through+inhibition+of+phosphatase+activity+by+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia.</a> J Neurosci. 27, 3090(2007).</li>
<li>Refolo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholesterol-lowering+drug+reduces+beta-amyloid+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 8, 890(2001).</li>
</ol>

我々は、検出可能なプラズマ汚染することなくマウスからのCSFのシリアルサンプリングするための信頼性の高いプロトコルを説明。 1。全体の手順は、通常、マウスあたり10分（麻酔を含む）を取ります。 CSF得られたの体積は、マウス系統に依存しています。 P301L（JNPL3）マウス3が約10μL-15μlの収率を得た一方、PS / APPダブルTgマウスではused2、平均容積は、約5μL（3〜7μL）です。シリアルサンプリングの場合は、7-8μlの最大は、安全に2-3ヶ月の間隔でそれぞれの時間を撮影することができます。 2。手術中は、大槽の硬膜を十分に露出することができるように定位固定フレーム上で適切にマウスの頭と体を配置することが重要です。アポ4の免疫ブロットによりCSFのサンプルで監視できる血漿タンパク質、からの汚染を防ぐためにキャピラリチューブを硬膜を貫通するときに慎重に血管を避けてください。 3。組織の癒着は、以下のサンプリングのための素因出血によって難易度を増加させることができるように各手術時の組織損傷を最小限に抑えることは、重要です。 4。麻酔によって引き起こされる低体温が大幅に非常...

大槽マウスでの脳脊髄液のシリアル収集のためのテクニック

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

アルツハイマー病（AD）は、病理学的にβ-アミロイドペプチド（Aβ）と過リン酸化タウタンパク質の神経細胞内蓄積の細胞外沈着によって特徴づけられる進行性神経変性疾患である。脳脊髄液（CSF）は脳の細胞外空間と直接接触しているので、それは病理学的プロセスに対応して脳内の生化学的変化を反映しています。これらの変化の原因のメカニズムはまだ完全には理解されていないものの、AD患者のCSFは、42アミノ酸Aβ（Aβ42）の形態、および総タウと過リン酸化タウの増加の減少を示しています。 ADのトランスジェニック（Tg）マウスモデルでは、どのように、なぜAβやタウのレベルCSFの変化で病気の進行状況に応じて調査する絶好の機会を提供しています。ここで、我々は、マウスからの脳脊髄液のサンプリングのための洗練された大槽穿刺のテクニックを示しています。この非常に穏やかなサンプリング手法は、シリアルCSFのサンプルが大幅にそれが可能な時間をかけて微妙な変化を検出すること、Aβまたはタウのレベルでの間に、マウスの変動の交絡影響を最小化する2〜3カ月ごとに同一のマウスから取得することを可能とする。 AβとタウELISAとの組み合わせで、この手法は、ADのマウスモデルにおける脳内のCSFAβ42とタウのレベルとの関係、およびそれらの代謝を調査するために設計された研究に有用となります。 Tgマウスの研究では、監視の病気の進行のための生物学的マーカーとして使用されるCSFのAβやタウのレベルの潜在的なまでに重要な検証を提供することができる、そして治療的介入の効果を監視する。マウスを屠殺することができ、脳の生化学的または組織学的変化を調べることができるように、CSFの変化のメカニズムは良く評価することができる。これらのデータは、ヒトADの脳脊髄液の変化の解釈のために有益であると思われる。

ADのトランスジェニック（Tg）マウスモデルでは、病気は人間の患者で進行するにつれてどのように、なぜCSFの変化でAβやタウのレベルを調査するために素晴らしい機会を提供しています。ここで、我々は、マウスからシリアルCSFのサンプリングのための洗練された大槽穿刺のテクニックを示しています。

アルツハイマー病（AD）は、病理学的にβ-アミロイドの細胞外沈着を特徴とする進行性の神経変性疾患であり...

まず、マウスを麻酔し、手術部位の準備を行います。次に、マウスを脳定位固定装置の上に腹臥位で配置します。後頭骨の下方で皮膚を正中方向に切開し、皮下組織と頚筋を正中線に沿って鈍的に剥離します。次に、固定した頭部に対して身体が135度の角度になるように体の後部を倒し、大後頭孔の硬膜をガラスキャピラリーで貫通させ、CSFを採取します。CSFのサンプリング後、筋肉を整えて皮膚を縫合し、脱水を防ぐために0.9% NaCl生理食塩水を約1 mL皮下注射し、マウスが回復するまで保温します。こんにちは、コロンビア大学The Top InstituteのDr. Karen Duffの研究室のLiuです。本日は、マウスのcisterna magna（大槽）から脳脊髄液を採取する方法をご紹介します。この手法を用いることで、同一のマウスから2〜3ヶ月の間隔で最大3回まで、連続的にCSFサンプルを採取することが可能です。当研究室では、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルを用いて、異なる年齢におけるCSF中のAβまたはtauレベルを測定し、それらの値を脳内の値と相関させるためにこの手法を利用しています。最後に、疾患の進行およびマウスを用いた治療試験における潜在的なバイオマーカーとして、CSFAのβまたはtauレベルの可能性について検討します。それでは、始めていきましょう。この手順では、マイクロピペットプルアーを用いてキャピラリーを作製する必要があります。本手法で使用するキャピラリーは、Sutter Instruments社製のBOAケイ酸ガラスB 175 10であり、Sutter P 87火炎マイクロピペットプラーを用いて、加熱指数を300、圧力指数を330に設定して作成します。ガラスキャピラリーの長さは5 cmで、先端はテーパー状になっています。キャピラリーの先端をハサミでカットし、内径を約0.5 mmに調整します。外科的手順は、ケタミン 100 mg/kg およびキシラジン 10 mg/kg を腹腔内投与してマウスを麻酔することから始めます。麻酔中は、マウスを 37 °C のインキュベーター内で保温してください。足指つまみによる逃避反射で動物が完全に麻酔されたことを確認した後、頸部を剃毛し、David Kink 社製などの脳定位固定装置にマウスを設置します。 heating pad に直接接触するように直腸温度プローブを挿入し、マウスの体温に応じてパッドの熱量を調整できるようにします。ヘッドアダプターで頭部を固定し、頸部の皮膚を10%ポビドンヨードと70%エタノールで3回拭き、後頭部または後頭骨の下方から正中切開を行います。以降の手順は、解剖顕微鏡下で鈍端ピンセットを用いて実施してください。皮下組織および筋肉（M ventor servicesおよびM rectus capita dorsalis major）を剥離し、大後頭神経の硬膜を露出させます。マイクロリトラクターを用いて、筋肉を適切に保持して広げてください。最後に、マウスを頭部が体に対して135度の角度になるように置きます。これで、CSF採取の準備が整いました。この大槽（cisterna magna）からCSFを採取する手法は、以前に報告されています。解剖顕微鏡下での図1 A。硬膜は光沢のある透明な逆三角形として現れ、その向こうに延髄と主要な血管が見える。dural spinella（硬膜脊髄動脈）図1 B。延髄および隣接するCSF空間の循環拍動が観察できる。滅菌綿棒で硬膜を拭いて乾燥させ、arteria dorsalis spinelsの外側から硬膜を貫通して、毛細管をcisterna magnaに挿入します。毛細管が正しく挿入されると抵抗感に明らかな変化があり、その後CSFが毛細管内に流入します。CSFを採取した後、注意深く毛細管を抜き、内径1 mmのポリエチレンチューブを用いて3 mLシリンジに接続します。CSFを0.5 mLチューブに分注します。チューブにラベルを貼り、直ちにドライアイスで凍結させます。凍結後、CSFを-80 °Cのフリーザーに移します。たった今実演したサンプリング手法は非常に低負荷であるため、2〜3ヶ月の間隔を空けて同一のマウスから継続的にCSFサンプルを採取することが可能です。したがって、サンプリング後は、頸部の筋肉と皮膚を元の位置に戻し、縫合して閉じます。切開部を縫合した後、マウスを再水和させるため、0.9%NACL生理食塩水を約1 mL皮下注射してください。マウスが回復するまで、約37 °Cで保温してください。術後1日目と7日目に体重を測定します。以上で、マウスのシステムバッグから脳脊髄液を採取する方法を説明しました。この手順を行う際、留意すべき重要な点が3つあります。第一に、Cy Magnaのatorを可能な限り露出させるため、マウスの頭部と身体を定位固定装置上に適切に配置してください。第二に、キャピラリーでデュロメーターを貫通させる際は、血管を慎重に避けてください。そうしないと、サンプルが血液で汚染されてしまいます。最後に、低体温症を防ぐため、処置中は常にマウスを保温することを忘れないでください。低体温症はマウスに有害であるだけでなく、β-カテニン産生やTLR4の低リン酸化を誘発し、結果に大きな影響を及ぼす可能性があります。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

a-technique-for-serial-collection-cerebrospinal-fluid-from-cisterna

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Joshi, K., et al.マウスのCisterna magnaを介して尾側脳幹と上部頚髄にマイクロインジェクションする定位外科的アプローチ。J. Vis.

マウスモデルにおける治療送達のための定位固定槽マグナアプローチ

出典: Zamboni, M., et al., Induction of Leptomeningeal Cells Modification via Icisternal Injection.J. Vis.

Cisterna Magna注射によるマウスモデルにおける標的薬物送達

出典: Xavier, ALR, et al.げっ歯類のマグナ槽へのカニューレ移植J. Vis.

マウスモデルにおけるシスターナマグナへのカニューレ移植

この動画では、ヒト由来の腫瘍細胞をマウスの脳の大槽に送達する手順を説明しています。同所性マウスモデルを使用して、がんの頭蓋髄膜への転移性転移を研究することができます。...

外科的大槽注射:マウスモデルの中枢神経系に腫瘍細胞を直接投与する方法

出典: Sweeney, A. M., et al.蛍光マクロスコピーを用いた無傷のマウス頭蓋骨を通る脳脊髄液輸送のin vivoイメージングJ. Vis. Exp. (2019)このビデオは、蛍光イメージングを使用してマウス脳内の脳脊髄液(CSF)の流れを視覚化するプロセスを示しています。蛍光トレーサーが大槽 (CM) に注入され、くも膜下腔および血管周囲腔を通して CSF によるその動きを追跡できるようになります。タイムラプス...

蛍光マクロコピーを使用したマウス脳における脳脊髄液輸送の in vivo イメージング

このプロトコルではない汚染血液から脳脊髄液 (CSF) の豊富なコレクションのための改善された技術について説明します。大きいサンプル コレクションと純度で、脳や脊髄に影響を与える病気の私達の理解を促進するため CSF...

麻酔下のマウスから脳脊髄液のコレクションのための改良法

ここチステルナ マグナ カニュレーション (CMc)、脳脊髄液 (CSF) にトレーサー、基板、シグナル分子を提供する低侵襲の方法を実行するプロトコルについて述べる。別の画像診断装置と組み合わせると、CMc が glymphatic システム、CSF のダイナミクス評価、様々...

齧歯動物の槽注入カニューレ

経頭蓋光学イメージングは、無傷の頭蓋骨を介して生きているマウスの皮質における脳脊髄液輸送の広視野イメージングを可能にする。...

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

高い脊髄液タンパク質レベルは、変化した血液脳関門または細胞内合成を横切る血漿タンパク質の拡散の結果であり得る。この記事では、両方のケースを判別するのに役立ち、インテコール内合成タンパク質の定量的測定を提供する最適化されたテストプロトコルを紹介します。...

マウスにおけるインテコール内合成タンパク質の定量測定

マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般に頭蓋骨を介したアクセスを含み、頭蓋骨のランドマークによって導かれる。ここでは、脳幹のランドマークの直接可視化に依存する大槽 マグナを介して...

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

ここでは、複数の神経疾患に重要な役割を果たすマウス髄膜リンパ管(MLV)を評価するプロトコルを提示します。このプロトコルの目的は、トレーサー排出の機能的評価と背面MLVネットワークの詳細な形態的特徴付けの両方を可能にする統合的手法を提供することです。...

髄膜リンパ質評価のための統合プロトコル:大胸椎注射、リンパ節画像診断、髄膜郭清、全マウント染色

学ぶ大槽マウスからの脳脊髄液シリアル採取法。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルでAβやタウの経時的変化を正確に測定し、疾患進行と治療効果評価に有用なバイオマーカー解析を可能にします。

大槽マウスでの脳脊髄液のシリアル収集のためのテクニック

さらに動画を探す