大槽マウスでの脳脊髄液のシリアル収集のためのテクニック

手順は、マウスの麻酔および手術部位の準備から始まります。次に、マウスを脳定位固定装置に腹臥位で設置します。後頭骨の下方で皮膚を正中線に沿って正中切開し、皮下組織と頸筋を鈍的に分離します。

次に、固定した頭部と身体が135度の角度をなすように身体の後部を配置し、大後頭孔の硬膜をガラスキャピラリーで穿刺して髄液を採取します。髄液採取後、筋肉を整えて皮膚を縫合し、脱水を防ぐために0.9% NaCl生理食塩水を約1 mL皮下投与し、マウスが回復するまで保温します。こんにちは、私はコロンビア大学Top InstituteのKaren Duff博士の研究室のLiuです。

本日は、マウスのcisterna magna（大槽）から脳脊髄液を採取する方法について説明します。この手法を用いることで、2〜3か月の間隔を空けて、同一のマウスから最大3回まで連続的にCSFサンプルを採取することが可能です。当研究室では、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、異なる週齢でのCSF中のアミロイドβまたはタウレベルを測定し、これらの値を脳内の値と相関させるためにこの手法を用いています。

最終的に、私たちは疾患の進行およびマウスを用いた治療試験における潜在的なバイオマーカーとして、CSFAのβまたはタウレベルの可能性に関心を持っています。それでは、始めていきましょう。この手順では、マイクロピペットプルラーを用いてキャピラリーを作製する必要があります。

ここで使用したキャピラリーは、Sutter Instruments社のBOAシリケートガラス B 175 10であり、Sutter P 87フレーム式マイクロピペットプラーを用いて、ヒートインデックスを300、プレッシャーインデックスを30に設定して作成しました。ガラスキャピラリーの長さは5 cmで、先端はテーパー状になっています。キャピラリーの先端をハサミでカットし、内径を約0.5 mmに調整しました。

手術手順は、ケタミン 100 mg/kg およびキシラジン 10 mg/kg を腹腔内投与してマウスを麻酔することから始め、麻酔中は 37 °C のインキュベーター内でマウスを保温します。足趾へのピンチ刺激による逃避反射で動物が完全に麻酔されていることを確認した後、頸部を剃毛し、David Kink 社などの脳定位固定装置にマウスを設置します。ヒートパッドに直接接触するように直腸温度プローブを挿入し、マウスの体温に応じてパッドの温度を調整できるようにします。

ヘッドアダプターで頭部を固定し、頸部の皮膚を10%ポビドンヨードと70%エタノールで3回清拭した後、後頭部または後頭骨の下方に正中切開を加えます。以降の工程は、解剖顕微鏡下で鈍的なピンセットを用いて行います。皮下組織および M ventor services と M rectus capita dorsalis major を分離し、sternum magna の硬膜を露出させます。マイクロリトラクターを用いて、適切に筋肉を保持してください。

最後に、マウスを横たえ、頭部を体に対して135度の角度に配置します。これでCSF採取の準備が整いました。大槽からCSFを採取するこの手法は、以前に報告されています。

解剖顕微鏡下の図1A。硬膜は光沢のある透明な逆三角形として現れ、その向こう側に延髄と主要な血管が確認できる。硬膜脊髄動脈（図1B）。延髄および隣接する髄液腔の循環拍動が観察される。

滅菌綿棒で硬膜の水分を拭き取り、脊髄背動脈の外側から硬膜を貫通して、毛細管を大後頭孔に挿入します。毛細管が正しく挿入されると抵抗感に明らかな変化があり、脳脊髄液が毛細管内に流入します。脳脊髄液の採取後、慎重に毛細管を取り出し、内径1 mmのポリエチレンチューブを用いて3 mLのシリンジに接続します。

CSFを0.5 mLチューブに分注します。チューブにラベルを貼り、直ちにドライアイスで凍結させます。凍結後、CSFを-80 °Cのフリーザーに移します。

今示したサンプリング手法は極めて低侵襲であり、2〜3か月の間隔を空けて、同一のマウスから後続のCSFサンプルを採取することが可能です。したがって、頸部のサンプリング後には、筋肉と皮膚を元の位置に戻し、縫合して閉じます。切開部を縫合した後、マウスを再水和させるため、0.9%NACL生理食塩水を約1 mL皮下注射します。

マウスが回復するまで、約37°Cで保温してください。術後1日目と7日目に体重を測定します。以上で、マウスのcisterna magnaから脳脊髄液を採取する方法を説明しました。

この手順を行う際には、3つの重要な注意点があります。まず、Cy Magnaのローターを最大限に露出させるため、脳定位固定装置上でマウスの頭部と身体を適切に配置してください。次に、キャピラリーでデュロメーターを貫通させる際は、血管を避けるように慎重に操作してください。

そうしないと、サンプルが血液で汚染されてしまいます。最後に、低体温症を防ぐため、処置の間はずっとマウスを温かく保つことを忘れないでください。低体温症はマウスに有害であるだけでなく、β-カテニン産生の誘導やAktの低リン酸化状態を招き、結果に大きな影響を与える可能性があります。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。