ラット上頚神経節（SCG）から培養交感神経のためのプロトコル

この手順は、出生0日目のラット新生児から上頸交感神経節を単離することから始まります。各脳には2つの上頸交感神経節が存在します。ラットの1腹から約24個の神経節を回収することができます。

神経節の分散は、30分間の処理から開始します。その後、火研磨したパステルピペットを用いて繰り返し攪拌し、単一細胞懸濁液を得ることでさらに分散させます。次に、交感神経ニューロンをコラーゲンENCコート皿に播種します。

こんにちは。私はコロンビア大学、病理学・細胞生物学部のLloyd Green博士の研究室に所属しているNila Zurinです。本日は、新生赤色マウスの上頸神経節から一次交感神経ニューロンを単離し、培養する方法を実演します。私たちの研究室では通常、これらの細胞を用いて、神経成長因子の除去に反応して起こるアポトーシスの研究を行っています。

それでは開始しましょう。まず、解剖を行う24時間前に、ラットテールコラーゲンで培養皿をコーティングします。実験の性質に応じて、24ウェルまたは48ウェルの培養プレートを使用します。

次に、溶液、培地、および器具を準備します。これらの材料および試薬は、このビデオに付随するテキストプロトコルで確認できます。ウリジンおよび5-FDU溶液は、使用直前に調製することが重要である点に注意してください。

火炎処理による準備を継続します。滴定ステップに使用するガラスパステールピペットを研磨します。ガラスピペットの先端を回転させながら数秒間火炎に当て、細く滑らかにします。

最初の火炎滅菌は、滅菌済みの細胞培養フード内で行ってください。解剖を開始するために、P0からP1の新生ラットを採取します。汚染を軽減するため、新生ラットの体表を70% ethanolで素早く拭きます。

斬首後、頭部を腹側が上になるように解剖パッドの上に置き、後頭部を自分の方に向けます。切断された気管が容易に確認できるはずです。滅菌済みの注射針を用いて、以下の方法で切断した頭部を解剖パッドに固定します。

ピン1本を口蓋からパッドに刺し、2本目のピンを切断した脊髄からパッドに刺します。解剖用パッドを顕微鏡の下に移動させ、接眼レンズを通して観察しながら、2組のピンセットを用いて気管周囲の皮膚と脂肪を取り除きます。深く刺しすぎないように注意すると、気管の両側にほぼ平行に走る一対の筋肉が現れます。

解剖中、滅菌パステールピペットを用いて冷やした滅菌PBSまたは冷やした無血清RPMI 1640培地を灌流し、過剰な血液を洗い流す必要があります。この操作は、作業速度に応じて1回または数回行います。その後、ピンセットを使用して、まず片側の筋肉を切除して取り除きます。

筋肉を取り除くと、総頸動脈が見えてきます。この動脈は気管に沿って走り、Y字型のリボンのように分岐しています。この分岐点は重要な指標であり、ここを特定すれば、上頸神経節を比較的容易に見つけることができます。

動脈の最も末梢端を切断し、ピンセットでわずかに持ち上げます。動脈のもう一端は付着させたままにします。この操作を行うと、上頸神経節が視認できるようになります。

分枝点において動脈に緩く付着している、アーモンド状で光沢のある小さな組織塊であり、神経節前または神経節後の糸状の連結線があることを確認します。2本目のピンセットを使用して、上頚神経節を慎重に剥離し、冷やした無血清RPMI 1640培地を含む35 millimeterの小型培養皿に入れます。次に、気管の反対側にある神経節を、同様のプロトコルに従って抽出します。

すべての神経節を摘出した後、不要な組織を可能な限り取り除きます。顕微鏡で観察すると、神経節に頸動脈の脂肪やその他の組織が付着しているのが分かります。ピンセットを用いて、これらの不要な物質を慎重に剥離させます。また、節前または節後の連結線も切り取ります。

各神経節には約10,000個のニューロンが存在します。ニューロンを播種すると、清浄化された状態でニューロンが再成長します。その後、神経節をRPMI 1640培地を含む滅菌済みの15 milliliter円錐型ポリプロピレンチューブに移します。

次に、交感神経ニューロンの培養を確立します。神経節を200 Gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。神経節を0.25%トリプシン溶液0.5から1 mLに再懸濁し、37 °Cの水槽またはインキュベーターに30分間置いて、神経節内の細胞を解離させます。

30分後、トリプシンを希釈し不活性化させるために、完全培地を10 milliliters添加します。その後、溶液を200 Gで2分間遠心分離します。上清を廃棄し、神経節を2 millilitersの最終培地で再懸濁します。

あらかじめ準備した開口部の広い火炎研磨済みピペットチップを用い、神経節を20回ほど吸い込みと排出を繰り返すことで、細胞をさらに分散させます。その後、チューブを数分間氷上に置きます。次に、ピペットを再度火炎研磨し、開口部をさらに狭くします。

ピペットが冷めた後、神経節をさらに20回トリチュレーション（摩砕）します。培地が徐々に濁ってきますが、これは細胞が解離していることを示しています。細胞の解離具合に応じて、この工程をさらに1回または2回繰り返します。

しばらくすると、神経節がニューロンへと解離し、チューブ内に完全な形の神経節は見られなくなります。この時点で解離しない組織物質が一部残る場合があります。未解離のデブリを底に沈殿させるため、チューブを氷上に数分間静置します。

上清から約50 µLを除くすべてを注意深く回収し、別のチューブに移します。未結合のデブリの混入を防ぐため、チューブの底に50 µLを残します。その後、解離した細胞が入ったチューブに最終培地を追加します。

添加する最終培地の量は、使用する培養プレートの種類によって異なります。ここではニューロンの培養に使用します。例えば、24ウェルプレートを使用する場合、1ウェルあたり0.5 mLの最終培地を用い、1ウェルにつき1つの神経節を播種します。

一般的なラットの1腹当たりの産子数は12匹であり、これにより24個の神経節が得られます。これは24ウェルプレート1枚に播種するのに十分な量であり、最終的な培地の総量は12 millilitersとなります。最終培地にuridine five FDUを使用することで、少数のグリア細胞およびその他の細胞種の増殖を抑制し、死滅を促進させます。

培養中の細胞には、培地の3分の2を交換することで48時間ごとに栄養を供給します。交換には、1%馬血清、NGF、ウリジン、および5 FDUを添加した新鮮なRPMIを使用します。当初、培養物には神経突起を持たない円形の交感神経ニューロンが含まれています。

短軸ニューロンは解剖の24時間後に可視化され、時間の経過とともに徐々に密度が増し、分枝が進みます。以上で、新生ラットの上頸神経節から一次交感神経ニューロンを単離し、培養する方法について説明しました。この手順を行う際は、まず時間をかけて丁寧に神経節を洗浄し、すべてのデブリ、血管、および脂肪を除去することが重要であるという点に留意してください。

この工程は、ほぼ均質で、他の細胞型が含まれていない培養液を確保するために重要です。2つ目に、解離ステップでは、ニューロンが大きな凝集塊にならないよう、時間をかけて丁寧に分離させてください。プレートに播種した後、大きな凝集塊があると困難が生じます。

ニューロンの切断や感染などのダウンストリームのアプリケーションにおいて、免疫染色の妨げになる可能性があり、ニューロンのカウントを必要とする実験も実施が困難になります。最後に、培地にペニシリン・ストレプトマイシンを補充する必要はありません。培養細胞にペニシリン・ストレプトマイシンを追加する場合、細胞を最初に播種した際のみで十分です。

培地を交換するたびに、新鮮なウリジンと5-FDUを培地に添加してください。当研究室では、神経成長因子の除去に応答したアポトーシスを研究するために、交感神経ニューロン培養を用いてきました。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。