Name: ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: 学ぶポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離・培養法。パパイントリートメント、パーコール密度勾配遠心分離、ポリ-D-リジン被覆プレートを用いた神経科学研究のための標準プロトコルです。

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我々は、貴重な提案をバーバラカルレッティとアンナマリーケニーに感謝します。 、DK07328：HYLはトレーニンググラント&quot;生化学分子生物学ホルモン&quot;によってサポートされています。 NIHの助成金5R01 NS16951（CAM）によって部分的にサポート。

パート1：（ビデオで示されていません）（解剖前に1〜2日）の設定<ol><li>培養液とメディアを準備： <ul><li> 4X CMF - PBS - EDTA（パーコールの希釈のためのカルシウムとマグネシウムのフリーリン酸緩衝生理食塩水- EDTA）：リットルは、32グラムのNaCl、1.2グラムのKCl、8 gのグルコース、2グラムのNaH 2 PO 4、1gのKH 2 POを追加する4、8 mLの2％のNaHCO 3の株式、脱イオン/蒸留水に10ミリリットル1MのEDTA（pH8.0）。 1リットルと7.4のpHに音量を調整します。滅菌フィルタします。 </li><li> HBSS -グルコース：カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液（HBSS）および滅菌フィルターにグルコース（6グラム/リットル）を追加。 500mlを、最大ヶ月間4℃で保存することができる。 </li><li>培養培地：無血清培地（SFM）および10％FBS培地。 Neurobasal A -培地48 mlに500μlの100Xグルタミン私、500μlの100Xペニシリン - ストレプトマイシン（最終の100単位のペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン）、6.25μlの2 M KClを（250、最終μM）に追加します。 9ミリリットルの2アリコートと40mlの分割。 10％FBS培地を準備するには、9 mlのアリコートに熱不活化FBSの1mlを加える。 SFMを準備するには、40mlのアリコートに無血清サプリメントB - 27の800μlを加える。滅菌濾過し、2週間の最大のために4℃で保存します。最良の結果がそれぞれの実験のために新鮮な培地を作るために。 </li></ul></li><li>パーコール希釈の準備： <ul><li>パーコールは液体として供給され、それは使用前に酸性化する必要があります。 pHが7.4に達するまで株式を準備するには、1〜2時間の期間にわたってパーコールソリューションに少しで1N塩酸を少し追加。あまりにも急速にHClを添加すると、集計にパーコールが発生します。 1N塩酸の約6.5ミリリットルはパーコールの各リットル必要とされる。滅菌濾過し、4℃で保存します。 </li><li> 35％、60％（体積：体積）パーコールの希釈は、Percoll勾配のステップで使用されます。 、パーコール株式の35または60 mlを入れた100ミリリットルパーコールの希釈液を調製4X CMF - PBS - EDTA及び蒸留25mlの/最後のボリュームにH2O脱イオン水。 60％のソリューションに青トルイジンの数滴を追加し、それはインタフェースと細胞を視覚化するのに役立ちます。滅菌濾過し、4℃で保存します。 </li><li>不十分なバッファリングが手順の実行中に増加し、細胞死の原因となるので、4X CMF - PBS - EDTAは、3ヶ月以上経過であってはならない。 </li></ul></li><li>はPREPARINGカバーガラス：ガラスカバースリップは、（最高のキャロライナ生物供給会社からの場合）、軽く攪拌しながら室温で一晩10％塩酸で洗浄deonized /蒸留水で十分にすすぎ、70％エタノールに格納されています。ご使用の前に、単一のカバースリップは火炎滅菌簡単にエタノールが蒸発するまで、裸火（ブンゼンバーナー）を介して鉗子でそれらを保持することによって。 12 mmのガラス製カバースリップを6ウェル培養プレートの4ウェル培養プレートと25 mmのカバースリップに配置することができます。 </li><li>基板とのコーティングの培養容器：それらは簡単に顕微鏡下で可視化するためのガラススライドにマウントすることができるので、免疫蛍光染色または薬物治療ガラス製カバースリップの方が適しています。 、文化のための解剖、ガラス製カバースリップまたはプラスチック製の皿が（500μg/ mlのポリ- D -リジンでコーティングされている必要があります前に、多数の細胞が蛋白質またはRNAサンプルを収集するために必要とされている場合、セルはプラスチック製の培養上dishes.The夜を培養することができます。 μL/ウェル、6ウェルプレートで800または350μl/ウェル、4ウェルプレート用）。 5 mgの/ポリ- D -リジンのmlのストック溶液は-20 ° C、その後、滅菌deonized /蒸留水及び使用前に滅菌濾過右に希釈に格納されています。培養容器は、（メッキ前または少なくとも2時間用）37℃で一晩インキュベートし、メッキ前に滅菌蒸留/ deonized水の右で2回洗浄する。 </li><li> PREPLATING皿を準備：これらの料理は、基板の低濃度に、より容易に付着するグリア汚染物質を除去するために文化の前に分離された小脳の細胞をあらかじめめっきに使用されます。コー​​トポリ- D -リジンの皿あたり4ミリリットル（100μg/ mlの、これは培養に使用される濃度の1 / 5です注）と2つの60 mmのプラスチック培養皿。 （または、少なくとも解剖前に2時間用）37℃で一晩インキュベートする。右解剖前に、滅菌水で二回皿を洗うとフードで乾燥させるため、ポリ- D -リジン溶液を取り除く。 </li><li>オートクレーブや解剖の日に解剖ツールを殺菌、20分間70％エタノールでツールを浸す。必要なツール：Permasetはさみ、microdissectingはさみ、4デュモン第5位解剖鉗子。 </li></ol>パート2：解剖（解剖の日）の準備 - （ビデオで示される） 断りのない限り次の手順のすべては、組織培養フードで実行されます。 <ol><li> 70％エタノールで解剖エリアを拭う。 ℃の水浴中でまたは5％CO 2、37℃インキュベーターで37メディアを温める。 </li><li>新しいパパイン解離システムキット（ワーシントン）起動時には、アルブミン、オボムコイド阻害剤の溶液を調製。 32ミリリットルを追加します。EBSS（アールの平衡塩類溶液、キットに付属）のアルブミン - オボムコイド阻害剤の混合物へと他のコンポーネントを準備中に内容が溶解することができます。最初の使用のための再構成、そして℃で2-8で残りの溶液を格納し、各キットによって許可fiveアイソレーションが完了するまで使用してください。 </li><li>解離キット（各バイアルは、生後5日目マウスの4から15小脳の解離のために十分である）から一パパインのバイアルにEBSS 5 mlを加える。パパインが完全に溶解し、溶液が透明に表示されるまで、5％CO 2、37℃インキュベーターまたは37 5〜10分間℃の水浴中にパパインバイアルを置きます。解剖時の室温でのソリューションを維持する。 </li><li>解離キットから一つのDNaseバイアルにEBSS 500μlを添加します。 DNaseはせん断変性に敏感であるため、バイアルをタップすることで静かに混和。パパイン（終濃度20単位/ mlパパイン、0.005％DNase処理である）を含むバイアルに、このソリューションの250μlを追加します。ステップ5.1または6.1で使用するために残りのDNaseバイアルを保存します。 </li></ol>パート3：解剖と髄膜の除去<ol><li> C57BL/6Jマウスから顆粒細胞培養のための最適な年齢は生後4-6、EGL peaks1、10の顆粒細胞の前駆細胞の数。です。子犬を一度に1つずつ細かく分析し、小脳解剖子犬あたり1 6より分に解剖の時間を短縮しようとすると慣れてくると。速度は非常に重要である。 Percoll勾配のステップがバイパスされている場合、8つの生後日 - 5仔マウスは、1つの6穴培養プレート（または6 25mmのカバースリップ）または6つの4 - ウェル培養プレート（または24 12の十分な細胞を得ることができます - mmのカバーガラス）。おおよその収率は、子犬とメッキ密度あたり4〜5x106細胞がcells/cm2 1〜5X105の範囲が可能です。 15〜20％の細胞はパーコールステップ4中に失われているので、より多くの動物が同じ所望の細胞密度を得るために必要とされる。 </li><li>ピペット滅菌ファルコン15 mlコニカルプラスチックのチューブに60 mmのプラスチック製組織培養皿と10 mlのHBSS -グルコース15mlの。氷上に置く。 </li><li>フードの外側に、70％エタノールで子犬の頭を拭いてください。子犬の首を切るためにPermasetのはさみを使用してください。 （断頭は、ビデオには表示されません。） </li><li>フードでは、あなたが明らかに頭蓋骨の背面を見ることができるようデュモンの鉗子で頭をホールド。大後頭孔にmicrodissectingはさみを挿入し、目に向かってまっすぐにカットすることで脳にアクセスします。皮離れて鉗子、スキンを使用して、脳を露出するために頭蓋骨を持ち上げる。デュモンの鉗子を用いて、小脳とその周辺の中脳をピンチオフし、HBSS -グルコースで皿に移す。 （これは、小脳を操作し、小脳がまだ周囲の組織に接続されている場合は髄膜を除去する方が簡単です）。 </li><li>解剖顕微鏡下で、静かに小脳から髄膜皮とまたプレートに小脳を固定するために他の鉗子を使用しながら、ある晴れたデュモン第5ピンセットで葉の間。あなたは、小脳の表面に血管がわか​​ります。これらの血管は、髄膜を識別するための良い方法です。小脳はマットホワイト外観を取るまで、髄膜を取り外します。中脳の残りの部分から小脳を区切ります。その腹側にそれを回し、腹側小脳と隣接する中脳の間に赤のリボンのような脈絡叢を、削除してください。早く解剖と氷上で15 mlのコニカルチューブに冷HBSS -グルコースの各小脳を置きます。 3脳を解剖した後新鮮なHBSS -グルコースに解剖ソリューションを変更します。 </li></ol>パート4：細胞懸濁液<ol><li>一度すべての解剖が終了している、チューブからHBSS -グルコースを除去し、ステップ2.4​​で作成したパパイン溶液と交換してください。このキットは小さな断片に組織を切断推奨していますが、我々はそれがこの歳で小脳をカットしたりミンチする必要がないことがわかります。 37℃の水浴または、5％CO 2 37 15〜20分間℃のインキュベーターで組織+パパイン溶液（15 mlコニカルチューブに）置きます。 4〜8小脳、37℃で15分間° Cで十分です。小脳、20〜30分の大きい数のために優れています。ゆっくりとチューブごとに3〜4分に撹拌。 </li><li> FBSでコーティングされている滅菌P1000エアロゾルのピペットチップとの混合物を砕いて粉にする。どんな空気の気泡の形成を防ぐために穏やかに、この手順を実行してください。火災研磨したガラスピペットが使用されていますが、我々は血清コーティングされた無菌P1000エアロゾルのヒントが同様に作用することに気付くことができます。二回使用直前に上下コートFBSとピペットチップ、ピペットFBSをに。ピペットで最大10程度とダウンの動きは、組織を解離するのに十分です。溶液は濁りになります。サスペンションは非常に解離していない組織の任意の大部分は、チューブの底に沈降することを30〜60秒間座ってすることができます。 </li><li> Bで解離していない組織片を削除しないように注意して浮遊細胞を（削除する血清コーティングされたピペットチップで新鮮な15 mlコニカルチューブにottom）。室温で5分間、約200xgで遠心分離します。再懸濁培地を準備します。これを行うには、滅菌チューブに再構成されたアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液300μlで2.7ミリリットルEBSSを混ぜる。ステップ2.4​​からDNase溶液150μlを加え。 </li><li>遠心分離後、上清を廃棄し、すぐに血清コーティングP1000のエアロゾルピペットの先端で、ステップ4.3で作成した希薄化後のDNase /アルブミン阻害剤溶液で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>次のように不連続密度勾配を準備します。 15 mlコニカルチューブにアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液5mlを追加。上に注意深く層細胞懸濁液。室温で6分間、約70xg間遠心する。チューブの下部に解離細胞ペレットは、膜断片は、インタフェースのまま。 </li><li>あなたが顆粒細胞に富む文化を取得したい場合は、Percoll勾配分離ステップを（小脳顆粒細胞の純粋な文化を表します）バイパス、およびパート6に進みます。あなたがさらにPercoll勾配分離によってグリアと大型介在から顆粒細胞を分離したい場合は、パート5に進みます。 Percoll勾配のステップの使用は、細胞の収率が低下します。私たちの手では、収量の減少は約20から35パーセントです。しかし、約90％から95〜99％の顆粒神経細胞と前駆細胞の濃縮の増加がある。 </li></ol>パート5：Percoll勾配分離<ol><li>上清を捨て、すぐにステップ2.4​​からのDNase50μlをHBSS -グルコース2mlにペレットを再懸濁します。重力によるナイロンメッシュ（孔径70μm以下）も、細胞懸濁液をフィルターします。このステップでは、大規模な非神経細胞を除去し、よりよい単一の細胞懸濁液のために提供されます。 </li><li> twoファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを準備します。これを行うには、静かに炎ガラスピペットの先端をエッジが平滑化されるまでとピペットボアは元のサイズの40〜50％です。開口部が小さすぎるように注意してください。 </li><li> Percoll勾配を準備します。 50ミリリットル滅菌コニカルチューブに35％パーコール溶液の代わりに10ミリリットル。 60％パーコール（10ml）を添付滅菌脊髄針、10 mlの滅菌注射器にロードされます。脊髄針とチューブの底に60％溶液を加えて35重量％溶液を下にそっと層60％パーコールのソリューションを、。 2つの層の間のシャープな界面を維持するように注意してください。優しくインタフェースを妨げることなく、チューブの側面に沿ってそれらを追加、ファイアーポリッシュピペットを用いて勾配の上部にセルを追加します。 </li><li> 1800xgで遠心し、遠心でチューブを静かに置きます。それが目的の速度に達するまで約2分かかるように：スピード一歩ごとに20秒（約18、70、200、440、850、1100、1800xg速度の増分は次の通りです）に上昇。 1800xgに達すると10分にタイマーを開始します。終了したら、徐々に一歩ごとに20秒を短縮減少。 </li><li>グラデーションの左上インタフェースを（大グリア細胞、プルキンエ細胞、及び介在を含む）を取り外して廃棄します。 </li><li>慎重にファイアーポリッシュピペット及び50 mlコニカルチューブに移すと35％、60％パーコールの間のインターフェイスでセルを削除します。反転数回でHBSS -グルコースとミックスの3倍量に再懸濁します。 1100xgで5分間遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、DNase50μlと10％FBS培地を4 ml加える。穏やかに、単一の細胞懸濁液を形成するためにファイアーポリッシュピペットを用いてペレットを再懸濁します。 6.2に進みます。 </li></ol>第6部：プレめっきおよびめっき<ol><li>上清を捨て、すぐにステップ2.4​​からのDNase50μlの10％FBS培地4 mlにペレットを再懸濁します。重力によるナイロンメッシュ（孔径70μm以下）も、細胞懸濁液をフィルターします。このステップでは、大規模な非神経細胞を除去し、よりよい単一の細胞懸濁液のために提供されます。 </li><li>プレートを5％CO 2、37℃インキュベーターで20分間ポリ- D -リジンコートしたプレメッキ皿上に回収した細胞。新鮮な料理を繰り返します。アストログリアと重い細胞が落ち着くと皿に付着し、小さな顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞をフローティング状態のままになります。インキュベーション後、ゆるく付着した顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞が簡単に外れているとプレートの穏やかなタッピングをほぐした。 </li><li> 5分間200xgで15 mlコニカルチューブと遠心分離機の顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞を収集する。無血清培地1mlにペレットを再懸濁し、血球計算盤を用いて10μlのアリコートを数える。 </li><li>所望の細胞密度に到達する無血清培地を追加。中密度のためのプレートに細胞数の大まかなガイドライン：6ウェルプレート、3.5から4000000セル用、4ウェルプレート用、65万細胞。 6ウェル培養プレートのため、私はプレート1.5ミリリットル/ウェル、4のためのよくPLATESは、私プレートを0.5ml /よく。細胞は、5％CO 2、37℃インキュベーター中で維持されます。後続の変更毎に2〜3日と24時間後に完全に培養液を交換する。 </li></ol>

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このプロトコルは、過去3,7,11に記載されている手順の変更に基づいています。以下に述べるように注意することは、いくつかの重要な点があります。 顆粒ニューロンおよび前駆細胞は、メッキの2時間以内に従っている。健康な細胞は位相差顕微鏡の4の下にある丸い形態を持っている。メッキ後24時間以内に、健康な細胞はカバースリップまたはプラスチック製のよく周りに均等に広がっていくとプロセスを形成します。第1の媒質の変化の時に、24時間後に、いくつかの死んだ浮遊細胞が存在します。これは、少数の細胞が死ぬか、解離の過程で不健康になるので、正常です。 48時間後の細胞はそれらのプロセスに対してvaricositiesと一緒に凝集している場合は、、細胞が不健康であるか、またはポリ- D -リジン基質は毒性がありますどちらか。ほとんどの基板と同様に、ポリ- D -リジンの有効性は多くの依存しており、それぞれの新しいロットをテストする必要があります。健全な文化のイメージが参照4,11、および20に見つけることができます。最大2週間〜8のために健康な細胞を培養で維持することができます...

<table><tbody><tr><td>セルストレーナー（メッシュ孔径 70&amp;mu;m）</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>脊髄穿刺針</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 inches</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine（分子量&amp;gt;300,000）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Poly-D-Lysineの新しいバッチごとにテストを行う必要がある。</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>カルシウムおよびマグネシウム不含である必要がある。</td></tr><tr><td>Neurobasal A-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I サプリメント</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B-27 無血清サプリメント (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 円形カバーガラス</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>ドイツのDeckgluder製。</td></tr><tr><td>25 mm 円形カバーガラス</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>ドイツのDeckgluder製。</td></tr><tr><td>パパイン解離システム</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>キット1つにつき5回の分離に使用可能。</td></tr><tr><td>Permaset 鋏</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>4ウェル培養皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル培養皿</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

小脳皮質は神経細胞の特性と開発の1,2を研究するためのユニークな機会を提供するだけでなく説明する構造です。小脳ニューロンタイプ（顆粒細胞、プルキンエ細胞と抑制性介在）のうち、顆粒ニューロンは、これまでで最も多数あり、哺乳類の脳における神経細胞の中で最も豊富なタイプです。げっ歯類では、小脳顆粒ニューロンは小脳皮質、外顆粒層（EGL）の最外層の前駆細胞からの最初の二つの出生後の数週間の間に生成されます。ここで紹介するプロトコールは、豊かにする技術と文化の顆粒ニューロンと出生後のマウスの小脳からそれらの前駆細胞を説明します。我々は、顆粒ニューロン5,6に前駆細胞の増殖分化を研究するために使用することができます増やす純度3,4の文化を、取得する手順を説明します。一度前駆細胞が分化、文化はまた、シナプス形成、グルタミン酸受容体の機能7、他の精製された小脳細胞8,9または細胞死7との相互作用などの現象の実験的操作と特性評価のための顆粒神経細胞の均質な集団を提供しています。

ここでは、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロン前駆細胞や小脳顆粒ニューロンを分離して培養する方法を提示する。

小脳皮質は詳細に記述されている構造であり、ニューロンの特性や発達を研究するための独自の機会を提供します1,2。

この手順は、P4からP5のマウスから小脳を摘出することから始まります。新生児マウスの個々の小脳から髄膜と脈絡叢を除去し、15 mLコニカルチューブに回収します。その後、パパインを用いて小脳を解離させ、穏やかなトリチュレーションによって単一細胞懸濁液にします。この懸濁液を、孔径 70 micron のナイロンメッシュを用いて重力ろ過します。ろ液を不連続 Percoll 密度勾配の上に静かに重層し、遠心分離を行うことで、顆粒細胞をグリア細胞、ニューロン、およびパキンゼ細胞に分離します。勾配の界面にある細胞を回収し、ポリリジンコートプレート上で調製します。さらにグリア細胞を除去するため、顆粒細胞を回収して計数し、ポリリシンコートしたガラスカバースリップまたはプラスチック培養プレートに目的の密度で播種します。こんにちは。コロンビア大学病理学部のLloyd Green博士の研究室のHey Young Leeです。本日は、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロンを単離し、培養する手順について説明します。当研究室では、顆粒神経前駆細胞の増殖と分化を研究するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。この手順は、解剖領域で70% ethanolを使用することから始まり、小脳顆粒細胞を解離させるためにPapin解離システムを使用します。新しいキットを使用し始める際は、 albumin OVO equate MOID 阻害剤溶液を調製します。調製方法は、キットに付属している Earl's balanced salt solution（EBSS）を 32 milliliters 取り、それを albumin OVO moid 混合物に加えます。成分を溶解させるため、他のコンポーネントを準備している間にそのまま置いておきます。次に、解離キットに含まれるパパインバイアル1本にEBSSを5 mL加えます。バイアル1本につき、P5マウスの小脳4～15個分を解離させることができます。その後、パパインバイアルを5%CO₂、37 °Cのインキュベーターに5～10分間置き、パパインが完全に溶解して溶液が透明になるまで待ちます。解剖中は溶液を室温に保持します。次に、キットに含まれる1D NASバイアルにEBSSを500 µL加えます。バイアルを軽く叩いて静かに混ぜ合わせます。DNASは剪断変性に敏感であるため、この溶液250 µLをペパネのバイアルに加え、最終濃度を20 units/mLおよび0.005%DNAにします。残りのDNA溶液は後の工程で使用するために保存してください。器具と試薬の準備が整ったら、本手順に従って小脳の解剖および髄膜の除去を行います。生後4日から6日のC 57 black sixマウスを使用します。この週齢範囲は、外顆粒層（EGL）の顆粒細胞前駆細胞数が最大になるため、顆粒細胞の培養に最適です。まず、60 mmプラスチック組織培養皿にHBSS glucoseを15 mL、滅菌済みの15 mLコニカルチューブに10 mL分注します。チューブを氷上に置き、仔マウスの頭部を70% ethanolで拭きます。精密鋏を用いて頭部を切り出します。頭部をフード内に移動させ、後頭部がはっきりと見えるようにピンセットで固定します。脳に到達させるため、大後頭孔にマイクロ解剖用鋏を挿入し、眼球に向かって直線的に切開します。極細のデュモンピンセットを使用してください。5番目に、ピンセットで皮膚を剥ぎ取り、頭蓋骨を持ち上げて脳を露出させます。次に、小脳と周囲の中脳を摘出します。これをHBSS glucoseを含むディッシュに移します。小脳が周囲の組織に付着している状態の方が、小脳の操作や髄膜の除去が容易であることに注意してください。次に、組織を解剖顕微鏡の下に置きます。その後、片方のピンセットを使用して、小脳をプレートに固定します。5番のデュモント微細ピンセットを用い、小脳の表面および小葉の間から髄膜を慎重に剥離します。小脳の表面に血管が確認できるはずです。これらの血管は、髄膜を特定するための有効な指標となります。小脳がマットな白色に見えるまで、髄膜の除去を続けてください。その後、小脳を中脳の残りの部分から分離します。腹側を上に向け、腹側小脳と隣接する中脳の間にある赤いリボンのように見える脈絡叢を除去します。小脳を切り出した直後、氷上の15 milliliter conical tubeに入れた冷たいHBSS glucoseに浸します。3つの脳を切り出した後、解剖液を新しいHBSS glucoseに交換してください。小脳の摘出に慣れてきたら、1匹あたりの摘出時間を6分以内に短縮するようにしてください。摘出が完了したら、細胞懸濁液の作製に進みます。小脳摘出組織から細胞懸濁液を作製する手順に移行してください。まず、チューブからグルコース含有HBSSを除去し、パパイン溶液に交換します。キットでは組織を細かく切断することが推奨されていますが、この週齢ではその必要はないと考えられます。組織とパパイン溶液を5%CO₂、37°Cのインキュベーター内で15～20分間静置します。小脳が4個から8個の場合は15分間インキュベートします。それ以上の数の場合は、最大30分間インキュベートしてください。3〜4分おきにチューブを静かに振とうさせます。インキュベーションが完了したら、tationステップを開始します。滅菌済みのP 1000エアロゾルピペットチップにFBSを吸い込み、2回ピペッティングしてチップをコーティングします。次に、混合液をトリガーレートします。気泡が発生しないよう、丁寧にピペッティングしてください。ピペットで10回ほど吸い上げと排出を繰り返せば、組織は十分に解離します。溶液は濁った状態になります。その後、懸濁液を30〜60秒間静置し、解離していない大きな組織片がチューブの底に沈殿するようにします。火炎研磨したガラスピペットを滴定に使用することも可能ですが、血清でコーティングした滅菌済みのP 1000チップでも同様に機能することがわかっています。次に、血清コーティングしたピペットチップを使用して、懸濁細胞を新しい15 mLコニカルチューブに移します。この際、底にある未分離の組織片を取り除かないよう注意してください。その後、細胞懸濁液を約200 Gで5分間遠心分離します。遠心分離の間、室温でresus懸濁液を調製します。まず、滅菌チューブにEBSSを2.7 milliliters加えます。次に、再構成したalbumin OVO MOID阻害剤溶液を300 microliters加えます。最後に、DNA溶液を150 µL加えます。遠心分離が完了したら、上清を捨て、直ちに細胞ペレットを希釈したDNAアルブミン阻害剤溶液で再懸濁します。この際も、ペレットの再懸濁には血清コーティング済みのピペットチップを使用してください。次に、不連続密度勾配を調製します。まず、15 mLコニカルチューブに albumin oval MOID 阻害剤溶液を 5 mL 加えます。細胞懸濁液をチューブの壁面に沿って静かに加え、溶液の上に層を形成させた後、約 70 G で 6 分間遠心分離します。室温で静置すると、解離した細胞はチューブの底にペレットとして回収され、膜断片は界面に残ります。顆粒細胞を濃縮した培養物を得たい場合は、それ以上の精製を行う必要はありません。上清を除去し、直ちにペレットを50 µLのDNaseを含む10%FBS培地4 mLで再懸濁します。この懸濁液を孔径 70 microns のナイロンメッシュを用いて重力ろ過します。この工程により、大きな非神経細胞が除去され、より良好な単一細胞懸濁液が得られます。その後、次に行う Percoll 密度勾配分離工程をスキップし、細胞播種工程へと進みます。あるいは、顆粒細胞をグリア細胞や大型介在ニューロンからさらに精製したい場合は、Percoll密度勾配遠心法に進んでください。上清を捨て、直ちにペレットを2 mLのグルコース含有HBSS（50 µLのDNaseを含む）に再懸濁します。再度、懸濁液をナイロンメッシュでろ過します。Percoll密度勾配分離を開始する前に、火炎研磨したパスチャーピペットを2本準備します。ピペットの先端を緩やかに火炎処理し、縁が滑らかになり、ピペットの開口径が元の約半分のサイズになるまで加熱してください。開口部を小さくしすぎないよう注意してください。次に、per call勾配を作成します。35% per call溶液10 mlsを50 mlの滅菌コニカルチューブに入れます。その後、60% per call溶液10 mlsを、滅菌スピナル針を装着した10 mlの滅菌シリンジに充填します。シリンジのチップをチューブの底に触れさせ、60%溶液を35%溶液の下に静かに重ねます。2つの層の間に明確な界面が維持されるように注意してください。次に、勾配の最上層に細胞を加えます。火炎滅菌したピペットを用い、界面を乱さないようにチューブの壁面に沿ってゆっくりと細胞を添加します。細胞を層状に重ねた後、チューブを慎重に遠心分離機にセットします。約 18 G で遠心を開始してください。20秒ごとに1段階ずつ速度を上げ、約2分かけて 1800 G に達するようにします。1800 G で 10分間遠心した後、20秒ごとに1段階ずつ徐々に速度を下げてください。遠心分離が完了したら、勾配の上層インターフェースを取り除いて廃棄します。このインターフェースには、大型のggl bikini細胞および介在ニューロンが含まれています。次に、火炎滅菌したピペットを使用して、インターフェースにある細胞を慎重に回収します。細胞を50 mLチューブに移します。液量が15 mLを超えている場合は、2本の50 mLチューブに分けて、3倍量のHB S'S glucoseに再懸濁し、数回反転させて混合します。その後、1100 Gで5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、10% FBSと50 µLのD ns reusを含む培地を4 mL加えます。火炎滅菌したピペットを用いてペレットを穏やかに懸濁させ、単一細胞懸濁液を作成します。細胞の再懸濁が完了したら、プレプレーティング（prepl）に進みます。回収した細胞をポリリシンコート皿上で20分間プレプレーティングします。37°C、5%CO2のインキュベーター内で培養します。培養中、アストログリアやサイズの大きい細胞は沈降してディッシュに接着しますが、小さな顆粒ニューロンやニューロン前駆細胞は浮遊したままか、あるいは弱く接着した状態になります。20分後、ディッシュを軽く叩いて、弱く接着している顆粒細胞を剥離させます。次に、細胞懸濁液を新しいポリリジンコートプレートに移し、インキュベーションを繰り返します。続いて、顆粒ニューロンおよびニューロン前駆細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、200 Gで5分間遠心分離します。その後、ペレットを1 mLのC free mediumで再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて計数します。最後に、中密度で播種するために、目的の細胞密度になるまで無血清培地を加えます。6ウェルプレートの場合、4ウェルプレートあたり約350万〜400万個の細胞を使用します。650,000 個の細胞を使用します。細胞は 37 °C、5% CO2 のインキュベーター内で維持してください。初回播種から 24 時間後に培地を完全に交換し、その後は 2〜3 日ごとに交換します。以下は、健康な顆粒細胞および前駆細胞の培養画像です。播種後24時間および播種後6日目の状態を示しています。これらの細胞は、最大2週間まで培養を維持することが可能です。播種後24時間以内に、健全な細胞はカバーグラスまたはプラスチックウェルの周囲に均一に広がり、突起を伸ばすことに注意してください。細胞の凝集や細胞突起に数珠状の腫れ（varicosities）が見られる場合は、細胞の状態が不良であるか、またはポリリシン基質が毒性を示していることを意味します。図に示されているように、顆粒細胞前駆細胞は播種直後から分化を開始し、マーカーを発現します。分化の代表例。培地にsonic hedgehogを添加することで、顆粒細胞前駆細胞の増殖を大幅に延長させることができます。また、神経突起の伸展を促進するために、ポリリシンの他に基質としてラミニンを添加することも可能です。顆粒細胞培養のこれらの特徴は、顆粒ニューロンの生物学、または前駆細胞からニューロンへの分化調節を研究するためのシステムを提供します。ここでは、MAO小脳顆粒神経前駆細胞およびニューロンの単離と培養方法について説明しました。この手順を行う際は、予想収量が約 4～5 × 10⁵ であることを覚えておくことが重要です。1匹の子マウスあたり6個の細胞が得られ、播種密度は5×10⁴ cells/cm²の1倍から5倍の範囲で調整可能です。したがって、Percoll勾配遠心ステップを省略した場合、生後5日のマウス子マウス8匹から、4ウェル培養プレート6枚分に十分な細胞を得ることができます。私の経験では、Percoll勾配ステップを用いると細胞回収率は約20〜30%減少します。しかし、培養物中の顆粒ニューロンの割合は90%から95%、さらには99%まで増加します。Percoll勾配分離ステップを用いずに得られた濃縮顆粒細胞は、顆粒ニューロン前駆細胞の増殖および分化の調節に関する研究に使用されてきました。ただし、培養物をin vitroで数日以上使用する場合は、増殖する非ニューロン細胞による顆粒ニューロンへの混入を減らすため、Percoll勾配ステップを組み込むことが推奨されます。また、Percoll勾配の作製に使用する溶液は必ず新しいものを使用してください。緩衝能が不適切であると、細胞死が増加するためです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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