Name: dna extraction, quantification, and cutting
Uploaded: 2019-01-31T09:26:45.000Z
Duration: 4 min 46 s
Channel: JoVE

K12 Standards

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North Carolina K-12 Science Standard Course of Study

9-12

Biology

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Heredity- Inheritance and Variation of Traits

LS.Bio.8.1

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DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis

DNA 추출은 세포에서 DNA를 제거하고 정제하는 것입니다. 첫째, 세포는 용해되어 부서져 열리는데, 일반적으로 물리적 파괴와 세포와 핵막을 용해시키는 세제와 같은 화학 물질로 처리되는 조합입니다. SDS 또는 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate)은 이러한 막을 구성하는 단백질과 지질을 용해시켜 작동하는 일반적으로 사용되는 세제입니다. 그런 다음 내용물이 주변 용액으로 자유롭게 떠다닐 수 있습니다. 

다음으로, DNA는 존재하는 다른 분자와 분리되어야 합니다. 반응에 첨가된 단백질 분해 효소 K는 펩타이드 결합을 분해하고 오염 단백질을 소화합니다. 그런 다음 소금을 샘플에 첨가하여 DNA의 골격에서 음전하를 띤 인산기를 안정화하고 얼음처럼 차가운 알코올을 첨가한 후 DNA를 용액 밖으로 침전시킵니다. 흰색 침전물은 원심 분리기에서 회전시켜 튜브 바닥에 침전시켜 수집합니다. 완충 용액에서 세척하고 재현탁한 후 추출된 DNA는 최종적으로 연구 또는 생명 공학 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 

개인에 특이적인 DNA의 새로운 패턴을 식별할 수 있는 DNA 지문 채취와 같은 일부 생명공학 응용 분야에는 제한 효소의 사용이 포함됩니다. 제한 효소는 DNA와 상호 작용하고 특정 염기서열을 인식하는 분자입니다. 일단 그들의 특정 부위가 확인되면, 그들은 DNA를 잘라낸다. 이로 인해 가닥이 하나 이상의 선형 조각으로 절단됩니다. 추출된 DNA가 박테리아에서 가장 흔히 발견되는 원형 DNA 조각인 플라스미드인 경우, 절단으로 인해 DNA가 선형 단편 또는 단편을 형성하게 됩니다. 서로 다른 제한 효소는 서로 다른 DNA 염기서열을 인식하므로 이러한 효소의 조합을 사용하면 별개의 단편이 생성될 수 있습니다. 

DNA 지문 채취에서는 DNA 또는 겔 전기영동이라는 기술을 사용하여 이러한 단편을 검사할 수 있습니다. 겔을 준비하기 위해 분말 아가로스를 완충액과 혼합하고 용해될 때까지 가열합니다. 그런 다음 뉴클레오티드 얼룩을 따뜻한 혼합물에 첨가한 다음 이 용액을 주조 주형에 붓습니다. 우물을 형성하기 위해 빗이 삽입됩니다. 응고되면 겔은 완충액으로 채워진 겔 상자로 옮겨지고 빗이 제거됩니다. 알려진 길이의 염색된 DNA 단편의 참조 혼합물인 DNA ladder를 하나의 웰에 추가하고 관심 있는 염색된 DNA 샘플을 나머지 웰에 로드합니다. 상자는 전원에 연결되어 있고 전원을 켜면 DNA 뉴클레오티드의 음전하를 띤 인산기 인산기가 겔을 통해 양극, 즉 양극으로 이동하도록 유도합니다. 작은 조각은 큰 조각보다 더 빠르게 움직이며 어렵게 이동합니다. 

실행이 완료되면 겔을 자외선에 노출시켜 DNA 샘플의 뉴클레오티드 염색을 시각화합니다. 그들의 존재는 사다리 띠에 대한 상대적 위치에 따라 확인할 수 있습니다. 염기서열이 다른 DNA는 서로 다른 위치에 절단 부위가 있기 때문에 개인이나 변이 DNA 프로파일을 구별하는 데 사용할 수 있는 새로운 띠 패턴 또는 지문을 생성할 수 있습니다. 

이 실험실에서는 SDS가 있거나 없는 버퍼를 사용하여 DNA 추출을 수행하여 DNA 분리에서 세제의 중요성을 평가한 다음 다른 제한 효소로 플라스미드 DNA를 분해하여 결과 DNA 프로파일을 검사합니다.

dna 분리 및 제한 효소 분석

DNA가 모든 유기체의 유전 분자라는 사실이 밝혀짐에 따라 엄청난 과학적, 의학적 발전이 이루어졌으며 우리 자신과 다른 유기체에 대한 이해가 크게 향상되었습니다. DNA 분리 및 프로파일링은 지난 세기 동안 많은 발전의 근본적인 첫 번째 단계였습니다. 유전자 기능의 식별에서 농업 및 법의학의 혁명에 이르기까지.

<h4>세포에서 DNA 분리</h4>

DNA 분리는 세포 채취, 용해, 단백질 분해 및 마지막으로 DNA 침전과 같은 몇 가지 필수 단계를 필요로 하는 매우 간단한 절차입니다. 일반적으로 DNA는 식물의 잎 하나, 동물의 모낭 또는 상피 세포와 같은 소량의 조직에서 채취할 수 있으며, 이러한 조직은 간단한 식염수로 입 안에서 쉽게 벗겨낼 수 있습니다. DNA는 진핵 세포 내의 핵 또는 미토콘드리아 내부에 구획화되어 있기 때문에 과학자들은 먼저 세포와 핵막을 분해하여 DNA를 노출시키며, 이 작업은 용해 단계로 수행됩니다. 그러나 DNA는 일단 노출되면 중금속 이온과 극한의 pH에 의해 분해될 수 있습니다. 따라서 세제 함유 완충 용액은 세포막을 용해시킬 뿐만 아니라 용액의 분해 원소로부터 DNA를 보호하는 데 사용됩니다. 더욱이, DNA는 히스톤(histone)이라고 하는 특별한 단백질을 단단히 둘러싸서 핵 내부에 응축되어 있는 비정상적으로 긴 분자입니다. 따라서 단백질의 펩타이드 결합을 분해하는 Proteinase K라는 효소를 첨가하여 히스톤 및 기타 단백질에서 DNA를 분리합니다. 다음으로, 과학자들은 DNA의 화학적 성질을 이용하여 세포 추출물의 나머지 부분과 DNA를 분리합니다. 핵산의 음전하 구조로 인해 염화나트륨 용액의 Na+ 이온은 얽힌 DNA 가닥에 결합하여 통합됩니다. DNA가 뭉치면 육안으로 관찰할 수 있습니다. DNA는 알코올에 녹지 않고 저온에서 쉽게 침전되기 때문에 과학자들은 차가운 알코올을 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 마지막으로, 침전된 DNA는 사용될 때까지 핵산을 분해할 수 있는 효소가 없는 탈이온수 또는 약한 완충액에 용해되어 보관할 수 있습니다.

<h4>DNA 정량화</h4>

DNA를 사용하는 반응은 종종 고순도와 정확한 양의 DNA를 필요로 합니다. 따라서 DNA 분리 후 과학자들은 분광 광도계를 사용하여 샘플에 있는 DNA의 양과 샘플에 있는 DNA의 순도를 정량화합니다. 분광 광도계는 샘플을 통과하는 광선의 강도를 파장의 함수로 측정합니다. 핵산은 260nm에서 빛을 흡수하는 반면 단백질은 280nm에서 빛을 흡수합니다. 과학자들은 260nm에서 광선의 강도를 측정하여 DNA 농도를 결정할 수 있습니다. 또한 260nm 및 280nm 모두에서 광도를 평가하여 DNA 함량의 순도를 결정할 수 있습니다. 순수한 DNA 샘플에서 260/280nm 비율은 2의 값에 가까워야 합니다.

<h4>제한 효소</h4>

DNA 단편 및 게놈 클로닝, 염기서열분석 및 매핑과 같은 여러 분석의 경우, 분리 효소를 사용하여 특정 염기서열에서 분리된 DNA를 절단해야 합니다. 이러한 효소는 박테리아가 침입하는 바이러스 DNA에 대항하는 선천적 면역 메커니즘으로 생성되며 분자 가위로 기능합니다. 그러므로, 제한 효소는 바이러스 DNA를 확인한 후, 그들이 인식하는 특정 뉴클레오티드 염기서열에서 그것을 분절로 잘라서 그것을 분해하기 시작합니다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 종종 6-12개의 뉴클레오티드 길이이며 일반적으로 회문이며, 이는 3'-5' 및 5'-3' 방향에서 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 것을 의미합니다. 예를 들어, 제한 효소 EcoRI는 염기서열 3'에서 DNA를 절단합니다. GAATTC...-5'는 5'-3' 방향으로 동일하게 읽습니다. EcoRI와 마찬가지로 많은 별개의 회문 서열에 해당하는 수백 개의 효소가 있습니다. 이 효소에 의해 DNA가 절단되면 과학자들은 DNA를 전기영동 챔버의 겔에 적재하고 겔을 통해 전류를 전달할 수 있습니다. DNA는 음전하를 띠고 있어 DNA 조각이 양극으로 이동합니다. 그러나, 젤의 숨구멍은 더 작은 DNA 서열에 비해 더 큰 DNA 단편을 감속시키며, 따라서 조각은 그들의 크기에 따라 분리됩니다. 전기영동이 완료된 후 DNA 분자에 특이적으로 결합하는 염료를 사용하여 DNA 단편을 시각화할 수 있습니다.

제한 효소로 DNA를 절단하고 전기영동으로 DNA 단편을 분리하면 연구자들은 표준 ladder를 기준으로 알려지지 않은 단편의 크기를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 관심 단편을 추가로 분리하고 유전자 클로닝을 위한 플라스미드 벡터로 연결할 수 있습니다. 유전 공학 및 실험실 분석은 이러한 방법으로 크게 개선되었습니다. DNA 프로파일링을 통해 과학자들은 게놈 염기서열을 분석하여 유기체의 작용을 더 잘 이해할 수 있으며 특정 유전자를 식별하고 특성화할 수도 있습니다1.

DNA 분리 및 프로파일링은 일상 생활에 직접적인 영향을 미치는 사건에도 실용적입니다. 예를 들어, 법의학 과학자들은 형사 및 민사 소송에 대한 증거를 제공하기 위해 정기적으로 DNA 샘플을 분석합니다2. 마찬가지로 의료 종사자는 DNA를 추출하고 분석하여 친자 확인 및 유전 질환을 확인합니다. 최근 DNA 혈통 분석 키트는 사용자가 자신의 유전적 혈통을 확인하고, 친척을 찾고, 다양한 건강 상태에 대한 유전적 성향을 발견할 수 있도록 함으로써 인기를 얻었습니다3. 마지막으로, 생명공학과 유전공학의 발전으로 개인 맞춤형 의학은 개인의 유전자 데이터를 사용하여 치료법을 개발하기 위해 임상 연구자들 사이에서 주목을 받고 있으며, 해로운 부작용 없이 환자를 효과적으로 치료할 수 있는 길을 닦고 있습니다4.

<h4>참조</h4>

<ol class="참조">
	<li>Chambers, GK 등. 동물학에서의 DNA 지문 채취: 과거, 현재, 미래. 조사 Genet. 2014, Vol. 5, 3 doi : 10.1186 / 2041-2223-5-3.</li>
	<li>로워, L. 법의학에서의 DNA 지문 채취: 과거, 현재, 미래. 조사 유전자. . .2013, Vol. 4, 22 doi: 10.1186/2041-2223-4-22.</li>
	<li>Kirkpatrick, BE 및 Rashkin, MD. 혈통 검사와 유전 상담의 실습. J Gen 상담. 2016년, Vol. 26, 1 (6-20).</li>
	<li>매사추세츠주 함부르크 및 FS, 콜린스. 개인 맞춤형 의료로 가는 길. N 영어 J 메드 . 2010; , Vol. 363, 301-304.</li>
</ol>

DNA 분리 및 제한 효소 분석

모든 유기체에서 유전 분자로서의 DNA의 계시는 엄청난 과학 및 의학적 돌파구를 이끌어 냈으며 우리의 ...

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dna extraction, quantification, and cutting

DNA extraction, quantification, and cutting are key steps in many biology labs. Scientists use these methods to study genes, prepare DNA for testing, and compare fragments for analysis.

DNA isolation starts with a small sample, such as a leaf, hair follicles, or epithelial cells from the mouth collected with a saline solution. The first steps are cell harvesting, lysis, protein degradation, and DNA precipitation. Lysis breaks open the cell and nuclear membranes so the DNA can be released from the nucleus or mitochondria in eukaryotic cells. A detergent-containing buffer helps dissolve membranes and also protects DNA from degrading conditions such as heavy metal ions and extreme pH.

After the DNA is exposed, Proteinase K is added. This enzyme breaks peptide bonds in proteins and helps separate DNA from histones and other proteins. The DNA is then mixed with sodium chloride, and Na+ ions help the tangled DNA strands clump together because nucleic acids carry negative charges. Cold alcohol is added next, since DNA does not dissolve in alcohol and will precipitate at low temperatures. The DNA can then be dissolved in deionized water or a mild buffer for storage, as long as the solution is free of enzymes that could break it down.

Once DNA is isolated, scientists often measure how much DNA they have and how pure it is. A spectrophotometer does this by sending light through the sample at specific wavelengths. DNA absorbs light at 260 nm, while proteins absorb light at 280 nm. The 260 nm reading shows DNA concentration, and the 260/280 ratio helps estimate purity. In a sample of pure DNA, that ratio should approach 2.

For cloning, sequencing, and mapping DNA fragments or genomes, scientists often need to cut DNA at specific sites. They use restriction enzymes, which are bacterial proteins that act like molecular scissors against invading viral DNA. These enzymes recognize short nucleotide sequences, often six to twelve bases long, and the sequences are usually palindromic, meaning they read the same in both directions. EcoRI is one example and cuts at the sequence GAATTC.

After cutting, the DNA fragments are loaded into a gel and separated by electrophoresis. DNA is negatively charged, so it moves toward the anode when an electric current is applied. Smaller fragments travel faster through the gel pores than larger ones, so the pieces separate by size. Dyes that bind to DNA make the fragments visible, and researchers compare them with a standard ladder to estimate fragment size. The fragments can then be isolated and ligated into a plasmid vector for genetic cloning.

These methods support many modern applications. Scientists use DNA profiling to sequence genomes and to identify and study genes. DNA analysis also helps in forensics for criminal and civil cases, in paternity testing, and in checks for genetic diseases. Ancestry kits use DNA to help people trace lineage, find relatives, and learn about possible health traits. These tools also support personalized medicine, where researchers use a person’s genetic data to design treatments with fewer harmful side effects.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

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genetics of organisms

Mendelian Traits and Exceptions

Mendelian genetics explains how traits move from parents to offspring. Gregor Mendel studied pea plants in 1865 and showed that many visible traits are controlled by two alleles, or gene versions, with one inherited from each parent. He also found that some alleles are dominant and others are recessive. Mendel’s work was not widely accepted until 1900, and it took about 30 more years for Mendelian inheritance to fit into evolutionary theory. One reason for the delay was that real breeding...

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bacterial transformation

Plasmid DNA Transfer in Bacteria

Plasmid DNA transfer in bacteria helped launch modern genetic engineering. The idea traces back to Frederick Griffith’s work on pneumonia-causing Streptococcus pneumoniae in the early 20th century. He studied a rough, non-virulent R strain and a smooth, virulent S strain with a protective polysaccharide capsule. When he injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice survived. But when heat-killed S-strain bacteria were mixed with live R-strain bacteria, the mice died, and...

genetics

Learn how DNA is isolated, measured with a spectrophotometer, cut with restriction enzymes, and separated by gel electrophoresis for analysis.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting | JoVE K12

2분 길이의 강사용 가이드를 통해 DNA 분리 및 제한 효소 분석 수업을 준비하세요. JoVE Lab Manual의 Biology 실험을 위한 핵심 준비 단계를 다룹니다.

Biology의 DNA 분리 및 제한 효소 분석 강사용 준비 - 14K+ 조회수 | JoVE Lab Manual

13분 길이의 학생 프로토콜 영상을 통해 DNA 분리 및 제한 효소 분석 절차를 단계별로 따라 해보세요. JoVE Lab Manual의 Biology 컬렉션의 일부입니다.

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Genome Size and the Evolution of New Genes

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DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

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The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

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Preparation of Solutions and Materials
ExpandNOTE: For this lab to run smoothly, it is recommended to not exceed 12 samples per laboratory class.
First ...

DNA Isolation
ExpandNOTE: In this experiment you will perform DNA isolation under two experimental conditions: one using a buffer containing the detergent ...

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Reproductive Cloning

CRISPR

Synthetic Biology

Synthetic biology is an interdisciplinary science that involves using principles from disciplines such as engineering, molecular biology, cell biology, ...

Ribosome Profiling

Ribosome profiling or ribo-sequencing is a deep sequencing technique that produces a snapshot of active translation in a cell. It selectively sequences ...

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Gene Therapy

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Biofuels: Producing Ethanol from Cellulosic Material

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
In this experiment, cellulosic material (such as corn stalks, leaves, ...

Testing For Genetically Modified Foods

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Genetic modification of foods has been a controversial issue due to debated ...

Obtain and communicate information that summarizes the impact of biotechnology applications on the individual, society, and the environment, including agriculture and medicine.

LS.Bio.8.2

Understand genetic mechanisms for variation.

DNA Extraction, Quantification, and Cutting

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